對于細胞修復調理，小鼠在第0天接受照射(4.5Gy或9.5Gy)或化療(35mg/kg)，并在第2天進行成像。對于HSPC移植，用CellTracker Green染色約105個FACS分選的HSPC(lin-/c-kit+/Sca1+)，并在第1天靜脈注射。

在進行全骨髓移植時，四個月大的雄性C57BL/6J小鼠或雄性肌動蛋白-DsRed基因敲入小鼠在接受來自供體肌動蛋白-GFP基因敲入小鼠的25×106全骨髓細胞救治前4小時接受來自Cs137源的單劑量9.5Gy伽馬輻照。

在照射和移植后的第五天，對肌動蛋白-DsRed受體小鼠進行成像，并測量骨髓中的pO2。C57BL/6J小鼠被處死，提取股骨和脛骨，準備骨髓用于分析循環細胞。使用紅細胞裂解緩沖液在冰上裂解紅細胞。按照制造商的建議，對剩余的骨髓細胞部分進行計數、固定、透化并用PE結合的Ki-67染色。循環細胞的分析在SORPFACSAria II儀器上進行。

為了繪制血管圖，我們從供體C57BL/6小鼠身上抽取血液，分離RBC，用15μM的CFDA-SE在37℃下標記7×106 RBC 12分鐘(標記濃度約為20×106 RBC/毫升，在不含Ca+0.2%牛血清白蛋白+0.2g/L葡萄糖的PBS中)，然后洗滌2次。然后，我們將RBC懸浮于200μL400nMQtracker 655血管標記-PBS溶液或200μL 3mg/ml 70kDa RhodamineB-Dextran血管標記-PBS溶液中，并在成像前立即靜脈注射到供體Nes-GFP小鼠體內。

在體內抗Sca-1染色方面，我們首先證明了抗Sca-1抗體的體內特異性。我們給一只C57BL/6J小鼠靜脈注射了20微克的Trustainfcx(BioLegend目錄#B164564)以阻斷非特異性Fc結合。兩小時后，我們靜脈注射了約15μg PE-Cy7抗Sca-1抗體(BDBiosciences目錄#108114)和約15μg PerCP-Cy5.5大鼠IgG2a同型對照抗體(eBioscience目錄#45-4321-80)。然后，我們在24小時后對BM進行成像，發現與同型對照相比，抗Sca-1抗體具有很高的特異性(數據未顯示)。然后，我們在Nes-GFP小鼠中重復了相同的實驗。

圖像量化

使用軸向疊層，按照之前的方法計算出每個pO2測量值到最近的骨表面(骨膜)的距離。簡言之，利用勾股定理確定三維空間中到骨膜的最短距離。使用羅丹明B右旋糖酐信號測量血管直徑。該測量僅在x-y平面上進行，是血管腔的直徑。距離和血管直徑的測量均在ImageJ v.1.47p中進行。為便于顯示，調整了圖1a-b、1e、4a-b、擴展數據圖4、6和7以及擴展數據視頻1的亮度和對比度。所有圖像分析均在原始圖像上進行。在圖1a中，顯示的最大強度投影圖像僅包括藍色通道中約23μm的深度。我們沒有包括藍色通道的整個厚度，因為在最淺的深度，骨SHG信號覆蓋了圖像的大部分。

為了測量血管的距離，使用Fiji(ImageJA v.1.45b)將三維堆疊圖像重新切成垂直平面(Y-Z、X-Z)，并進行數字旋轉以消除頭骨相對于成像平面的傾斜。隨后，測量每個R/G/B通道沿Z方向的灰度強度曲線，并將其擬合為經驗指數衰減曲線，然后將其倒數乘以每個堆棧圖像，以均衡圖像強度與深度的函數關系。然后，將三維疊加圖像轉換成二值圖像，并手動驗證結構的準確性。在二值化的紅色(血管)通道堆棧圖像上應用精確歐氏距離變換(EEDT)函數，以32位灰度圖像堆棧的形式返回每個非血管像素到最近血管壁的三維距離。使用二值化藍色(骨骼)通道堆棧排除了骨髓空間以外的像素。因此，EEDT距離直方圖描述了骨髓內非血管空間中每個像素到最近血管的距離分布。

信噪比和統計分析

pO2測量值的信噪比(SNR)用以下公式計算：

其中，n是光子計數的數量，nBD是使用上述背景值確定的背景計數。nBD是暗計數和雜散光背景信號的總和，其中大部分來自暗計數。本研究不包括信噪比低于20的磷光測量。

實驗所需的樣本量是根據初步數據結果估算的。除圖1f和圖4c分別采用雙尾、配對學生T檢驗和單尾、配對學生T檢驗外，所有p值均采用雙尾、不等方差學生T檢驗。對同一數據集進行多次統計檢驗時，統計顯著性采用Bonferroni校正。所有實驗均未進行盲法或隨機化。

圖1 BM血管密度和含氧量。

(a)小鼠腓腸肌的可見光內最大強度圖像(約75μm厚)，顯示血管(紅色，Qtracker655血管染料)和骨(藍色，膠原SHG)。(b)三維虛擬成像堆棧的相應單個平面，顯示血管(紅色)、骨SHG(藍色)以及BM中每個血管外像素到最近血管壁的三維歐氏距離測量值(EDM，綠色)。(c)全三維成像堆棧中所有EDM的直方圖。(d)與骨膜和皮質骨血管中的pO2相比，骨髓中的pO2明顯較低。每個點代表一個單獨血管或間隙位置的pO2測量值(8只小鼠的骨膜、皮質骨、BM血管內和BM血管外的血管/位置分別為8、21、55和40個)。圖中顯示了每組數據的平均值(黑線)和±標準偏差(陰影框)。(e)血管從骨骼進入BM的最大強度投影圖像。骨骼(藍色)和血管(黃色)分別用SHG和RhodamineB-dextran/PtPC343熒光勾勒。兩個箭頭分別指向血管進入BM前后測量pO2的位置。(f)追蹤進入BM的單個血管時pO2的下降(n=4只小鼠的8根血管)。顯示的是每組數據的平均值(黑線)。刻度線~100μm。

圖2根據血管直徑和距骨膜內表面的距離，血壓pO2有所變化。

(a)血管平均直徑(綠線，4只小鼠的38根血管)、血管內(紅線，4只小鼠的38根血管)和血管外(藍線，3只小鼠的39個位置)pO2與骨表面到測量位置的距離呈函數關系。誤差為±標準偏差。(b)nestin+血管(紅色圓圈，n=9根血管，來自3只小鼠)和nestin-血管(藍色正方形，n=12根血管，來自3只小鼠)的直徑與骨內膜表面距離的函數關系圖。(c)同樣的nestin+血管和nestin-血管的pO2與血管直徑的函數關系圖。(d)nestin+(紅色圓圈，n=17根血管，來自7只小鼠)和nestin-(藍色方框，n=16根血管，來自5只小鼠)血管的pO2。顯示每組數據的平均值(黑線)和±標準偏差(陰影框)。

圖3細胞修復治療后和HSPC歸巢部位的BMpO2。

(a)亞致死(4.5Gy，n=5只小鼠的13個血管和29個血管外位置)或致死(9.5Gy，n=2只小鼠的40個位置)伽馬輻照兩天后，或丁胺(35mg/kg，n=6只小鼠的40個位置)調理兩天后的BM pO2。圖1d中未經處理的對照組pO2與之比較。(b)血管外pO2測量值與4.5Gy照射2天后測量位置到骨表面距離的函數關系圖(n=44個位置，來自4只小鼠)。(c)HSPC歸巢部位的pO2與丁胺苯磺吡啶治療受體的整體BM pO2的比較(n=17個HSPC，來自6只小鼠)。未觀察到有統計學意義的差異。在(a)和(c)中，顯示了每組數據的平均值(黑線)和±標準偏差(陰影框)。

圖4細胞修復調理后的活細胞膜血管圖譜和細胞性對局部pO2的影響。

(a)nestin-GFP小鼠的血管連接圖顯示，nestin+血管位于竇道的上游并向竇道排水。表示血流方向的箭頭是通過視頻速率成像跟蹤標記的RBC的移動確定的，并疊加在BM血管的最大強度投影圖上(紅色=血管染料，綠色=nestinGFP/RBC，藍色=SHG骨信號)。綠色實線表示血管與鄰近的nestin+細胞，白色虛線表示nestin-血管。縮放條~100μm。(b)一個通用DsRed受體的骨髓在移植了來自通用GFP供體的2，500萬個骨髓細胞5天后的體內圖像。紅色=DsRed，綠色=GFP，藍色=骨的SHG。縮放條~100μm。(c)移植后第2天(n=3只小鼠)和第5天(n=2只小鼠)，通過FACS對綠色(供體)和紅色(宿主)骨髓細胞進行Ki-67染色。每個符號代表不同的小鼠。刻度線(第2天)為平均值的±標準偏差。(d)與小的供體細胞群/單細胞(4只小鼠，n=16個位置)和宿主細胞群/單細胞(5只小鼠，n=40個位置)相比，大的供體細胞群(4只小鼠，n=19個位置)區域的體內pO2值。圖中顯示了每組數據的平均值(黑線)和±標準偏差(陰影框)。