材料與方法

菌株和種子培養(yǎng)物制備

本研究中使用的Penicillium decumbens JUA10由山東大學(xué)微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(SKLMT)惠贈(zèng)。將其保存在小麥麩皮汁斜面培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基包含1%(w/w)葡萄糖、10%(w/w)麩皮提取物和2%(w/w)瓊脂，于4°C保存。

Penicillium decumbens JUA10在100 mL液體培養(yǎng)基（包含1%(w/w)葡萄糖和10%(w/w)麩皮提取物）中，于30°C和180 rpm下預(yù)培養(yǎng)36小時(shí)，然后接種。

固態(tài)發(fā)酵條件

稻草生物質(zhì)在4.5 L蒸汽爆破反應(yīng)器（威海自控有限公司，中國(guó)威海）中，于1.5 MPa壓力下蒸汽爆破5分鐘。預(yù)處理后，將蒸汽爆破稻草(SERS)手動(dòng)切碎，平均顆粒長(zhǎng)度分別為4.0 cm、1.5 cm和0.4 cm。

固態(tài)培養(yǎng)基由蒸汽爆破稻草/麩皮(8.0 g/2.0 g)(w/w)和8.0 mL的1.5%(NH_4)_2SO_4、0.6%MgSO_4和0.3%KH_2PO_4無(wú)機(jī)鹽溶液組成。通過(guò)添加蒸餾水，將固態(tài)培養(yǎng)基的初始水分含量調(diào)整為65%、75%和85%。

在固態(tài)發(fā)酵接種前，固態(tài)底物在121°C滅菌30分鐘。滅菌后，固態(tài)底物在室溫下冷卻，并通過(guò)每克干底物添加0.5 mL種子液進(jìn)行接種。固態(tài)發(fā)酵在300 mL柱狀瓶中進(jìn)行，采用不同的水分含量(MC)和顆粒長(zhǎng)度，在30°C的搖床水浴中培養(yǎng)120小時(shí)。每24小時(shí)取樣發(fā)酵液并進(jìn)行分析。

底物形態(tài)結(jié)構(gòu)測(cè)定

在柱狀瓶中，每24小時(shí)使用高分辨率相機(jī)（35毫米佳能PowerShot A650，50毫米鏡頭）檢查發(fā)酵底物底部和頂面的形態(tài)結(jié)構(gòu)。^14每個(gè)樣品獲取20張數(shù)字圖像，并以JPEG格式存儲(chǔ)用于分析。使用120位、3264x2448像素矩陣進(jìn)行圖像抓取。圖像分析方案包括使用數(shù)字圖像處理方法改進(jìn)圖片，并使用MatLab 7.1計(jì)算分形維數(shù)。拍照和數(shù)字圖像處理的詳細(xì)步驟在之前的研究中有描述。^14

Penicillium decumbens JUA10生物量的測(cè)定

生物量通過(guò)葡糖胺法測(cè)定。^15，16首先，每12小時(shí)對(duì)發(fā)酵底物取樣，在80°C干燥箱中干燥，并用研缽手動(dòng)粉碎。將0.5克處理過(guò)的樣品溶解在10 mL 12 mol L^{-1}鹽酸中24小時(shí)，然后加入40 mL去離子水。將混合物在121°C加熱2小時(shí)。最后，將混合物過(guò)濾，濾液溶解至50 mL，取10 mL此液體用NaOH中和，然后用去離子水溶解至25 mL。

將1.0 mL乙酰丙酮溶液（由乙酰丙酮與0.5 mol L^{-1}Na_2CO_3按1:50(v/v)比例組成）加入1.0 mL葡糖胺提取液中，混合物在90°C下保持1.0小時(shí)。室溫冷卻后，加入6.0 mL乙醇和1.0 mL Ehrlich溶液，并在65°C下保持10分鐘。在530 nm處通過(guò)比色法測(cè)定樣品。

Ehrlich試劑是通過(guò)將2.67%(w/w)4-(二甲氨基)-苯甲酸乙酯溶解在乙醇和濃鹽酸（按體積比1:1混合）的混合液體中配制而成，用于1.0 L。

底物滲透率的表征

底物滲透率每24小時(shí)使用內(nèi)部實(shí)驗(yàn)室設(shè)備（專利申請(qǐng)?zhí)?01110204349.3）測(cè)定，重復(fù)三次。底物滲透率實(shí)驗(yàn)在30°C下進(jìn)行。

底物中氧氣分布的測(cè)定

由于微電極具有高空間精度和測(cè)量精度，使用微電極測(cè)定氧氣濃度。與普通的毫米級(jí)電極相比，它具有獨(dú)特的電化學(xué)特性，可以測(cè)量微環(huán)境的物理化學(xué)參數(shù)，并且不破壞測(cè)量點(diǎn)的生態(tài)環(huán)境。測(cè)量裝置微電極購(gòu)自丹麥Unisense。測(cè)量系統(tǒng)由皮安表、連接到步進(jìn)器的電機(jī)驅(qū)動(dòng)微操縱器以及控制和軟件分析組成。將電極垂直刺入發(fā)酵底物。電機(jī)驅(qū)動(dòng)微操縱器的速度保持在0.2 mm s^{-1}，測(cè)量距離為1.5-2.0 cm。每24小時(shí)在每組中的兩個(gè)不同點(diǎn)檢查發(fā)酵底物中的氧氣分布。

結(jié)果與討論

SSF底物的形態(tài)變化

我們之前的工作證明，微生物生長(zhǎng)引起的底物形態(tài)變化可以通過(guò)固態(tài)發(fā)酵的分形動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行定量表征，并且不同條件下真菌生長(zhǎng)引起的底物結(jié)構(gòu)變化也可以通過(guò)分形維數(shù)來(lái)表達(dá)。^14為了確定固態(tài)底物變化、真菌生物量以及不同水分含量和顆粒長(zhǎng)度的菌絲體-基質(zhì)分形維數(shù)之間的關(guān)系，在SERS/麩皮培養(yǎng)物上每隔24小時(shí)從頂部和底部?jī)蓚?cè)拍照。還系統(tǒng)地定量表征了真菌生物量與分形維數(shù)之間的關(guān)系，結(jié)果如圖1和圖2所示。

在生物量轉(zhuǎn)化過(guò)程中，固態(tài)底物的水分含量(MC)和顆粒長(zhǎng)度(PL)是影響生物量轉(zhuǎn)化效率和微生物生長(zhǎng)的主要參數(shù)，特別是對(duì)于固態(tài)發(fā)酵。^17，18結(jié)果表明，對(duì)于所有實(shí)驗(yàn)，從12小時(shí)到72小時(shí)的發(fā)酵時(shí)間內(nèi)，真菌生物量迅速增加，然后在72小時(shí)到120小時(shí)的發(fā)酵時(shí)間內(nèi)保持恒定值（圖1）。最大的生物量約為每克底物0.75克，在85%MC和0.4 cm PL條件下，發(fā)酵時(shí)間從12到120小時(shí)獲得（圖1）。圖1顯示，SSF中的真菌生物量在水含量實(shí)驗(yàn)中遵循85%>75%>65%的順序，在顆粒長(zhǎng)度實(shí)驗(yàn)中遵循0.4 cm>1.5 cm>4.0 cm的順序。結(jié)果表明，高水分含量和小顆粒長(zhǎng)度有利于真菌生物量的增加，可能是因?yàn)樗鰪?qiáng)了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)傳遞和利用效率。^19

底物形態(tài)結(jié)構(gòu)因發(fā)酵過(guò)程的利用和降解作用而被真菌生長(zhǎng)明顯改變。^20，21在使用Penicillium decumbens JUA10的SSF過(guò)程中，真菌菌絲體與底物交織在一起，形成難以分離的混合物。在先前的研究中，分形維數(shù)已被有效地用于評(píng)估真菌-底物復(fù)合物。圖2顯示，SSF中的分形維數(shù)在水含量實(shí)驗(yàn)中遵循65%>75%>85%的順序，在顆粒長(zhǎng)度實(shí)驗(yàn)中遵循0.4 cm>1.5 cm>4.0 cm的順序。結(jié)果表明，高水分含量和大顆粒長(zhǎng)度提供了最低的分形維數(shù)。同時(shí)，有趣的是，分形維數(shù)在發(fā)酵時(shí)間從12小時(shí)到48小時(shí)期間下降，然后在發(fā)酵時(shí)間從48小時(shí)到120小時(shí)期間增加。造成這種情況的可能原因是，在真菌生長(zhǎng)的早期階段，由于真菌占據(jù)底物內(nèi)部空間，分形維數(shù)降低。然而，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，真菌利用導(dǎo)致固態(tài)底物分解成小塊，這導(dǎo)致底物的分形維數(shù)逐漸增加。同樣有趣的是，發(fā)酵48小時(shí)后不同顆粒長(zhǎng)度的分形維數(shù)差異小于發(fā)酵48小時(shí)前的差異（圖2(B)）。造成這種情況的可能原因是，大顆粒長(zhǎng)度生物質(zhì)在48小時(shí)后被降解成小塊。同時(shí)，小顆粒長(zhǎng)度生物質(zhì)在發(fā)酵過(guò)程中容易團(tuán)聚，然后在固態(tài)發(fā)酵后期顆粒長(zhǎng)度生物質(zhì)的差異減小，這導(dǎo)致相應(yīng)的分形維數(shù)差異也減小。因此，結(jié)果表明，分形維數(shù)可以有效地表達(dá)底物形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，并且也可以在固態(tài)發(fā)酵中不同水分含量和顆粒長(zhǎng)度下表征真菌生物量的相應(yīng)增長(zhǎng)。