摘要

了解微環(huán)境或生態(tài)位如何調(diào)節(jié)干細(xì)胞活性，是理解干細(xì)胞生物學(xué)和制定干細(xì)胞治療策略的核心。低氧張力(缺氧)通常被認(rèn)為是維持多種干細(xì)胞類型靜止的共同生態(tài)位特征。然而，支持缺氧龕存在的證據(jù)主要來(lái)自間接證據(jù)，如蛋白質(zhì)組分析、HIF-1和相關(guān)基因的表達(dá)，以及替代性缺氧標(biāo)記物(如咪唑)染色。在這里，我們對(duì)活體小鼠骨髓(BM)中的局部氧張力(pO2)進(jìn)行了直接的活體測(cè)量。利用雙光子磷光壽命顯微鏡(2PLM)，我們確定盡管血管密度非常高，但骨髓的絕對(duì)pO2卻相當(dāng)?shù)?<32mmHg)。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了局部pO2的異質(zhì)性，在較深的竇周區(qū)域發(fā)現(xiàn)了最低的pO2(約9.9mmHg或1.3%)。相比之下，骨膜內(nèi)區(qū)域的缺氧程度較低，因?yàn)樵搮^(qū)域有小動(dòng)脈灌注，而這些小動(dòng)脈的標(biāo)記物nestin通常呈陽(yáng)性。這些pO2值在放療和化療后發(fā)生顯著變化，表明壓力在改變干細(xì)胞代謝微環(huán)境中的作用。

造血干細(xì)胞(HSC)龕位在BM內(nèi)的確切位置仍然難以確定，有證據(jù)支持血管龕位和骨內(nèi)膜龕位的存在。由于包括骨內(nèi)膜區(qū)域在內(nèi)的基底膜灌注密集，我們不禁要問(wèn)，如此高血管化的組織如何能在低氧微環(huán)境中孕育造血干細(xì)胞？我們通過(guò)仿真模型發(fā)現(xiàn)，在遠(yuǎn)離血管的短距離內(nèi)，可能存在非常陡峭的pO2梯度，從而形成缺氧區(qū)。然而，目前還沒(méi)有關(guān)于直接測(cè)量BM內(nèi)局部氧分布的報(bào)道。

擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2、PtP-C343溶液的PO2值與我們的顯微鏡記錄的磷光壽命測(cè)量值的函數(shù)關(guān)系圖。PO2由插入溶液中的氧氣微電極測(cè)定。實(shí)線是不同實(shí)驗(yàn)室記錄的同一批PtP-C343的已公布校準(zhǔn)曲線。

在這里，我們?cè)趯榛铙w動(dòng)物成像設(shè)計(jì)的雙光子顯微鏡上實(shí)現(xiàn)了2PLM技術(shù)。這種全光學(xué)設(shè)計(jì)(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1)可通過(guò)完整的頭骨以微米級(jí)的空間分辨率在BM內(nèi)的精確位置進(jìn)行非接觸式pO2測(cè)量。成像前，系統(tǒng)注入基于金屬卟啉的雙光子增強(qiáng)磷光探針PtP-C343。鉑卟啉(PtP)的發(fā)射三重態(tài)對(duì)局部氧氣濃度高度敏感。與溶解氧的雙分子碰撞會(huì)縮短探針的三重態(tài)壽命并淬滅磷光。因此，通過(guò)測(cè)量激發(fā)脈沖后的磷光衰減時(shí)間τ，就可以根據(jù)預(yù)先建立的τvs.pO2校準(zhǔn)曲線(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2)確定pO2的絕對(duì)值。PtP-C343中的金屬卟啉由樹(shù)枝狀聚合物和聚乙二醇(PEG)包覆層保護(hù)(擴(kuò)展資料圖3)，以確保生物相容性并防止探針與生物大分子發(fā)生不必要的相互作用。為了提高雙光子激發(fā)截面，在樹(shù)枝狀聚合物外殼上接枝了幾個(gè)香豆素-343(C343)分子，作為雙光子"天線"，通過(guò)分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移將捕獲的能量導(dǎo)向金屬卟啉。

探針中香豆素單位的殘余熒光使我們能夠通過(guò)傳統(tǒng)的雙光子激發(fā)熒光觀察到BM血管，同時(shí)通過(guò)膠原二次諧波發(fā)生(SHG)信號(hào)觀察到骨骼。我們證實(shí)，BM中的血管密度很高(圖1a-c)，圖像堆棧中95%以上的體素距離最近的血管小于25μm(圖1b-c)。然后，我們使用2PLM對(duì)血管內(nèi)多個(gè)位置的BM pO2進(jìn)行了量化，得到的數(shù)值范圍為11.7到31.7mmHg(1.5-4.2%)，平均值為20.4mmHg(2.7%)。這些值明顯低于大腦微血管、骨膜和皮質(zhì)骨中的pO2值(圖1d)。在許多情況下，我們能夠跟蹤單個(gè)血管從骨骼穿入BM腔的過(guò)程(圖1e)。當(dāng)沿著單個(gè)血管追蹤時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)在進(jìn)入BM腔前后測(cè)量到的pO2急劇下降(圖1e-f)。血液從低細(xì)胞度區(qū)域(皮質(zhì)骨)流向高細(xì)胞度區(qū)域(BM)，沿血流方向氧氣迅速耗盡，這讓人聯(lián)想到血管進(jìn)入代謝需求高的實(shí)體瘤時(shí)觀察到的縱向pO2梯度。

由于BM血管的通透性相對(duì)較高，注入的探針(直徑約3-4納米)擴(kuò)散出血管，并在幾分鐘內(nèi)積累到足夠的濃度(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4)，從而可以測(cè)量間質(zhì)空間的pO2。根據(jù)數(shù)學(xué)模型，我們發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)離血管的側(cè)向pO2梯度很陡，平均血管外pO2為13.3mmHg(1.8%)，范圍在4.8到21.1mmHg(0.6-2.8%)之間(圖1d)。

我們?cè)贐M中測(cè)得的pO2值(血管內(nèi)約20.4mmHg，血管外約13.3mmHg)與之前報(bào)道的使用氧電極測(cè)得的約18mmHg值非常吻合。不過(guò)，該測(cè)量方法缺乏空間分辨率，而且針電極的插入很可能損傷了微血管，因此只能記錄到血管內(nèi)和血管外pO2的平均讀數(shù)。盡管如此，綜合來(lái)看，這些結(jié)果支持這樣一種觀點(diǎn)，即盡管血管密度很高，但整個(gè)BM是一個(gè)缺氧組織。

為了更精細(xì)地觀察BM內(nèi)的氧分布，我們注意到血管是異質(zhì)的，較小的血管更靠近骨膜內(nèi)表面(圖2a)。直徑小于15μm的血管的2PLM顯示的pO2(22.7mmHg，3.0%)高于直徑大于15μm的血管(19.5mmHg，2.6%，p＜0.03)。因此，當(dāng)我們分析距骨膜不同距離的pO2值時(shí)，發(fā)現(xiàn)距骨>40μm區(qū)域的pO2值最低，血管內(nèi)為17.7mmHg，占2.4%；血管外為9.9mmHg，占1.3%(圖2a)。在大多數(shù)較小血管所在的骨膜內(nèi)區(qū)域(0-20μm區(qū)域)，pO2讀數(shù)略高，血管內(nèi)的數(shù)值為21.9mmHg(2.9%，p<0.03)，血管外的數(shù)值為13.5mmHg(1.8%，p<0.01)(圖2a)。這些測(cè)量結(jié)果表明，隨著與骨膜距離的增加，pO2梯度適中，但梯度的方向出乎意料。我們發(fā)現(xiàn)，pO2并非隨著距離骨膜的增加而降低，而是隨著距離骨膜的增加而向更缺氧的竇狀區(qū)域移動(dòng)，而不是骨膜內(nèi)區(qū)域最缺氧。

由于目前還沒(méi)有造血干細(xì)胞特異性標(biāo)記物可用于觀察平衡狀態(tài)下的內(nèi)源性干細(xì)胞，我們使用了nestin-GFP小鼠來(lái)幫助確定造血干細(xì)胞所在的位置。nestin由參與造血干細(xì)胞維持和運(yùn)輸?shù)腂M間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)亞群表達(dá)，血管周圍的nestin-GFP亮細(xì)胞定義了靜止造血干細(xì)胞龕位。我們推斷，如果缺氧調(diào)節(jié)靜止，那么nestin-GFP細(xì)胞就應(yīng)該是BM缺氧區(qū)域的標(biāo)志。在nestin-GFP小鼠中，我們證實(shí)nestin+細(xì)胞主要分布在血管周圍，移植的造血干細(xì)胞也靠近nestin+血管(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5)。nestin+血管與nestin-血管在解剖學(xué)上截然不同，它們更靠近骨表面(10.9μm vs. 25.5μm，p<0.02)，直徑更小(9.5μm vs. 22.9μm，p<2×10-6)(圖2b)。與我們的預(yù)期相反，我們發(fā)現(xiàn)nestin+血管的pO2明顯高于nestin-血管(22.8mmHg vs. 17.6mmHg，p<0.0007)(圖2c-d)。

接下來(lái)，我們研究了移植的造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞(HSPCs)是否歸巢于具有不同pO2水平的骨髓龕。移植前，受體動(dòng)物接受放射或化療(35mg/kg的丁胺卡那霉素)進(jìn)行細(xì)胞再生調(diào)理。值得注意的是，這兩種治療方法都導(dǎo)致了整個(gè)骨髓細(xì)胞pO2的大幅升高(圖3a)。考慮到放療和化療后血管都受到了嚴(yán)重破壞，pO2的升高令人震驚(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖6a-c)。此外，雖然亞致死照射(4.5Gy)后血管內(nèi)pO2值基本不變，但血管內(nèi)和血管外pO2之間的梯度消失了，血管外pO2上升到與血管內(nèi)pO2相同的水平(圖3a)。隨著與骨膜距離的增加，pO2下降的"負(fù)"梯度也消失了(圖3b)。在致命性照射和丁胺苯磺胺治療的病例中，廣泛的血管損傷導(dǎo)致染料大面積滲漏，以至于血管內(nèi)和血管外空間的界限再也無(wú)法劃分。