富氫培養(yǎng)基處理：

將金屬鎂棒放入DMEM/F12培養(yǎng)基（最終氫濃度為0.55-0.65Mm）中制成富氫培養(yǎng)基。使用針式氫電極（UnisenseA/S，丹麥奧胡斯）監(jiān)測氫濃度。

核磁共振成像：

核磁共振成像研究使用布魯克高場小動(dòng)物核磁共振成像系統(tǒng)進(jìn)行。在2Lmin-1氧氣中用2%異氟烷麻醉荷瘤大鼠，并維持在正常體溫。在腫瘤移植后的第17天和第26天，使用常規(guī)自旋回波序列采集每只大鼠的T2加權(quán)磁共振圖像，參數(shù)如下：TR=3140ms，TE=37ms，帶寬=130Hz，翻轉(zhuǎn)角=180°，F(xiàn)OV=4cm×4cm，切片厚度=1mm。

組織學(xué)和免疫組化：

用石蠟包埋膠質(zhì)瘤組織，然后切成8μm厚的切片。切片用3%過氧化氫處理10分鐘以滅活內(nèi)源性過氧化物酶，然后用10%正常山羊血清孵育。去除阻斷血清后，切片與一抗（包括抗-CD34、抗-Ki67、抗-CD133和抗-Nestin在4°C下孵育過夜。使用HRP結(jié)合的二抗進(jìn)行檢測，然后使用DAB試劑盒進(jìn)行比色檢測。所有數(shù)據(jù)均由雙盲研究人員進(jìn)行評估。

免疫熒光：

將細(xì)胞播種在蓋玻片上，用4%多聚甲醛固定10分鐘，用0.1%TritonX-100in PBS進(jìn)行通透，并用1%BSA封閉1小時(shí)。細(xì)胞核用Hoechst染色，并用倒置顯微鏡獲得熒光圖像。

流式細(xì)胞術(shù)：

用流式細(xì)胞術(shù)分析培養(yǎng)細(xì)胞中CD133的表達(dá)。簡言之，在4℃下用10%馬血清在PBS中孵育細(xì)胞10分鐘，然后在4℃下用一抗CD133孵育30分鐘。離心后，收集的細(xì)胞與FITC結(jié)合的二抗孵育20分鐘。染色后，使用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。

球形成試驗(yàn)：

收集并洗滌細(xì)胞以去除血清，然后以2.0×103/mL的密度懸浮于無血清DMEM或MEM/EBSS培養(yǎng)基中。每孔計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，并將其播種到超低附著力六孔板上進(jìn)行球形成試驗(yàn)。細(xì)胞在正常無血清培養(yǎng)基或含B27補(bǔ)充劑、20納克/毫升表皮生長因子（EGF）和20納克/毫升堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）的富氫無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)基每3天更換一次。細(xì)胞培養(yǎng)10天，計(jì)數(shù)直徑大于50μm的小球。

細(xì)胞遷移試驗(yàn)：

采用傷口愈合試驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力。簡單地說，將細(xì)胞以1.0×106個(gè)/孔的濃度接種到六孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24小時(shí)后，用塑料吸管尖在每個(gè)培養(yǎng)板的細(xì)胞表面劃一條線。用PBS沖洗剩余細(xì)胞三次，去除漂浮的細(xì)胞和碎片，然后在普通完全培養(yǎng)基或富氫培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時(shí)。分別在傷口愈合后和愈合后24小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)拍攝傷口愈合過程的數(shù)字圖像。傷口愈合試驗(yàn)分三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。

細(xì)胞侵襲試驗(yàn)：

細(xì)胞侵襲能力的測定采用BDmatrigel侵襲室，按照生產(chǎn)商的方案進(jìn)行。簡而言之，在帶有聚碳酸酯過濾器（孔徑為8μm）的上腔涂上50μL Matrigel（0.8μg/μL，37°C，2h）。將100μL無血清培養(yǎng)基中的1×105個(gè)細(xì)胞接種到上腔，然后在下腔加入650μL含氫或不含氫的普通完全培養(yǎng)基。然后用棉簽將上表面的細(xì)胞完全清除。下表面的細(xì)胞在固定后用0.1%（w/v）結(jié)晶紫染色，并從每個(gè)插入物中隨機(jī)抽取5個(gè)視野，在×100倍放大鏡下計(jì)數(shù)。侵襲試驗(yàn)在三重獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行。

菌落形成檢測：

每孔計(jì)數(shù)一千個(gè)細(xì)胞并將其播種在六孔板中。在含氫或不含氫的普通完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)14天，然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，并用0.1%結(jié)晶紫染色。只有當(dāng)菌落至少包括15個(gè)細(xì)胞時(shí)才進(jìn)行計(jì)數(shù)。進(jìn)行三重獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，所有可見菌落均以人工方式計(jì)算。

統(tǒng)計(jì)分析：

采用雙尾學(xué)生t檢驗(yàn)比較細(xì)胞培養(yǎng)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的各組數(shù)據(jù)，結(jié)果以均數(shù)±SEM表示。所有統(tǒng)計(jì)分析均使用GraphPadPrism6.01進(jìn)行。P<0.05的值被認(rèn)為具有顯著性。

結(jié)果：

1.吸入氫氣可抑制體內(nèi)膠質(zhì)瘤的生長

圖1：氫氣吸入還能抑制U87皮下小鼠模型的腫瘤生長（d)，腫瘤重量（e）和腫瘤體積（f）均有所下降。CTRL：對照組；HI：氫氣吸入組

圖1：氫氣吸入可抑制體內(nèi)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長。在大鼠C6腦膠質(zhì)瘤模型中，通過磁共振成像評估膠質(zhì)瘤的生長情況。拍攝了具有代表性的圖像（a）并對其進(jìn)行了量化（b）。氫氣吸入可延長中位生存期（c）。氫氣吸入也抑制了U87皮下小鼠模型中的腫瘤生長

分子氫對膠質(zhì)瘤細(xì)胞腫瘤生長的影響首先在大鼠C6膠質(zhì)瘤模型中進(jìn)行了評估。磁共振成像結(jié)果顯示，在植入C6細(xì)胞后的第17天，氫化組（54.76±6.07）與對照組（51.23±9.11）的腫瘤大小無明顯差異。但在第26天，HI組的腫瘤體積比對照組明顯縮小（223.3±33.83mm3vs.363.3±34.80mm3，p=0.045）（圖1a、b）。此外，吸入氫氣還能延長中位生存期（28.00天對31.00天，p=0.0012）（圖1c）。

為了證實(shí)分子氫對膠質(zhì)瘤生長的影響，我們使用了小鼠U87皮下模型。如圖1d-f所示，與對照組相比，吸入氫氣可顯著減少腫瘤重量（0.34±0.11gvs.0.79±0.11g，p=0.0078）和體積（181.30±48.02mm3vs.504.20±61.71mm3，p=0.0003）。