表觀總消化率：

為了測定營養物質的表觀總消化率，在每個實驗期的第18天至第22天，進行了4次24小時的尿液和糞便收集。母牛被飼養在單獨的收集欄中，并安裝了留置導尿球囊。糞便收集在放置在每頭小母牛身后的盤子里。每天從每頭小母牛身上采集10%的糞便子樣，并按期內小母牛進行合成。將具有代表性的樣本（500克）在55℃下干燥96小時，以測定DM。尿液收集在預裝4NH2SO4（500mL）的密閉收集容器中，以防止NH3-N的揮發。每天采集一份2%的酸化尿樣，然后按母牛的周期進行合成。尿液子樣以1:5的比例用蒸餾水稀釋，并儲存在-20℃溫度下，直至分析。

血液采樣：

第22天，在飼喂前和飼喂后6小時從母牛頸靜脈采集血樣。采血時使用兩個10mL含肝素鋰的真空管，用于血漿尿素氮（PUN）分析。試管在4℃溫度下以2,000×g離心20分鐘，然后將血漿轉移到微管中，在-20℃溫度下冷凍，直至分析。

反芻動物pH值記錄儀：

第25天，將pH記錄器放入每頭母牛的腹腔，以測定瘤胃pH值。使用LRC pH數據記錄器系統記錄瘤胃pH值，從第25天到第27天，每隔1分鐘記錄一次。記錄儀在使用前后使用pH4和pH7緩沖液進行了標準化處理。

箱體測量：

為了測量CH4排放量，將母牛分別飼養在4個開放式呼吸室（寬4.4m×深3.7m×高3.9m，容積63.5m3 MB）中。第26天，母牛被轉移到受控環境建筑物中，并被帶入分配給它們的飼養室，在那里立即喂食，并關閉飼養室的門。母牛在小室中飼養3次，每次24小時，每天打開小室一次，以便喂食和清潔。Beauchemin和McGinn對方法和排放計算進行了詳細描述。在研究開始之前和之后，都對樣品室進行了校準，并每天對儀器進行校準。不同樣品室的斜率差異小于5%，回收率在98%到106%之間。

化學分析和計算：

飼料、飼料殘渣和糞便樣品在55℃下烘干，以測定DM，然后通過1mm篩磨。對樣品進行分析，以測定DM方法、OM、灰分、中性洗滌纖維（NDF）和酸性洗滌纖維（ADF）。灰分含量通過在馬弗爐中于550℃下燃燒5小時測定。樣品按順序進行NDF和ADF分析方法，并對纖維分析儀進行修改，在NDF分析程序中加入熱穩定的α淀粉酶和亞硫酸鈉，NDF表示不包括殘留灰分。

為了測定淀粉和氮的含量，將干飼料和糞便的子樣品在球磨機中研磨。飼料、拒食飼料、糞便和尿液中的氮采用閃燃氣相色譜法和熱導檢測法定量。粗蛋白（CP）以N×6.25計算。淀粉的測定方法如下Herrera-Saldana等人。使用淀粉葡萄糖苷酶和1,4-α-D-葡聚糖葡萄糖水解酶的混合物水解α-葡萄糖聚合物。葡萄糖樣品的吸光度在Thermo Scientific Appliskan1.437微孔板閱讀器上以490納米的波長讀取。飼料和糞便樣品的總能量含量用炸彈熱量計測定。

溶解的H2是用氫氣電極（H2-500；Unisense，丹麥奧胡斯）測量的，電極連接在一個玻璃流通池（內徑2毫米，外徑6毫米）上。H2電極與微型傳感器萬用表（Unisense，丹麥奧胡斯）相連。傳感器的校準方法與Guyader等人所述相同。按照Dehority的描述，使用深度為1毫米的Levy-Hausser計數室在光學顯微鏡下對原生動物進行計數。使用氣相色譜儀測定瘤胃中的揮發性脂肪酸，氣相色譜儀配有30米長的Zebron游離脂肪酸相熔融石英毛細管，內徑0.32毫米，膜厚1.0微米。

NH3-N的濃度是按照Broderick和Kang所述的次氯酸苯酚法測定的。血漿中尿素氮的濃度是用微分流量分析儀，尿囊素的測定方法由Young和Conway描述，尿酸濃度的測定方法是使用商業試劑盒。

微生物氮合成量的估算采用了Chen和Gomes提出的計算方法：

其中，嘌呤衍生物總量（PD）是尿囊素和尿酸排泄量的總和（毫摩爾/天）。微生物流量（克N/天）的計算公式為：

制熱量（HP）是根據Brouwer提出的公式，利用3天試驗室測量中消耗的氧氣以及產生的甲烷和二氧化碳（CO2）的平均值計算得出的：

瘤胃微生物群落：

只有使用對照組或2.0%EB處理的母牛樣品才用于微生物分析。樣品經冷凍干燥后用咖啡研磨機研磨。使用Zymobiomics DNA提取試劑盒從0.1克冷凍干燥研磨樣品中提取DNA。通過使用NanoDrop分光光度計測量260/280和260/230吸光度的比率，確定提取的元基因組DNA的濃度和純度。使用引物27F和1398R進行PCR反應，擴增全長16srRNA基因，以確認樣品中不存在PCR抑制劑。

測序工作在麥吉爾大學和魁北克基因組創新中心進行，使用的是Illumina MiSeq Reagent Kit v2，遵循了制造商的指導原則。515F引物和806R引物靶向16srRNA基因的V4區域，用于檢測細菌和古細菌的多樣性。使用1μL1比10稀釋的基因組DNA和快速啟動高保真PCR系統進行33個循環的PCR，條件如下：94℃2分鐘，然后進行33個循環：94℃30秒，58℃30秒，72℃0秒，最后在72℃7分鐘進行延伸。使用FastStart高保真PCR系統在以下條件下將Fluidigm公司的條形碼納入第二個PCR反應：95℃10分鐘，然后進行15個循環：95℃15秒，60℃30秒，72℃1分鐘，最后在72℃下延伸3分鐘。擴增后，在2%瓊脂糖凝膠中評估PCR產物，以確認擴增是否充分。所有樣本均使用Quant-iT PicoGreen dsDNA分析試劑盒進行量化，并按等比例匯集。然后使用校準過的Ampure XP珠子對匯集的樣本進行純化。使用Quant-iT PicoGreen dsDNA分析試劑盒和Kapa Illumina GA with Revised Primers-SYBR Fast Universal試劑盒對匯集的樣本（文庫）進行量化。使用LabChip GX儀器測定平均片段大小。

將原始fastq文件導入Qiime2進行序列分析。使用插件cutadapt從序列文件中移除引物和適配器序列。移除引物和適配序列后，使用程序dada2進行質量控制，過濾測序數據中的任何phiX讀數，并移除嵌合序列。Dada2模型用于糾正Illumina序列數據中的錯誤，并生成一個包含菌株級分辨率序列計數數據（豐度）的特征表。在Dada2之后，使用Mafft程序進行多序列比對，并屏蔽高變異區域。用FastTree生成系統發生樹。使用使用Silva128參考數據庫和特征分類器插件訓練的樸素貝葉斯分類器將分類分配給序列。為確保α和β多樣性分析使用相同數量的序列，對所有樣本中的最低序列數進行了子采樣。多樣性插件core-diversity-metrics用于評估樣本內部（α-多樣性）和樣本之間（β-多樣性）的微生物多樣性。對α-多樣性、系統發育多樣性、觀察到的OTU數量、均勻度和分類豐度進行了評估。使用加權和非加權UniFrac進行了β-多樣性分析。序列已存入Small Reads Archive，登錄號為PRJNA534330。

統計分析：

數據使用SAS的MIXED模型程序進行分析。單變量程序用于驗證數據是否呈正態分布。在進行統計分析前，對原生動物計數進行對數10轉換，以符合方差均一性。所有變量的數據均以小母牛為實驗單位進行分析，但CH4測量除外，因為每頭小母牛在每個時期都飼養在同一試驗室內，所以試驗室內的小母牛為實驗單位。該模型包括EB作為固定效應，以及方形、方形內嵌套的小母牛和方形內嵌套的時期等隨機效應。在微生物分析中，還包括來源（LAM、SAM、FAM）的固定效應以及處理與來源的交互作用。對于瘤胃變量和血液參數，小時被視為重復測量，對于瘤胃室和pH值記錄儀測量，日被視為重復測量。使用SAS對連續的瘤胃pH數據進行總結，包括日平均值、最小值、最大值和標準偏差。在每個時期的4天內，計算每個試驗室每天的累計CH4排放量。使用Akaike信息標準的最小值來選擇適當的協方差結構。使用Tukey檢驗計算經錯誤發現率(FDR)校正的P值。當P<0.05時，宣布平均值之間存在差異，并使用對比聲明來檢驗線性和二次效應，系數根據非等距處理結構進行調整。弦線圖使用R Studio中的circlize軟件包生成。

結果:

表3：飼喂以大麥青貯料為基礎日糧的小母牛的干物質采食量和瘤胃發酵產物，其中大麥青貯料日糧含有增加添加的強化生物炭

各處理的干物質攝入量和總VFA濃度相似（P>0.21；表3）。飼喂0.5%和2.0%EB的母牛體內的乙酸濃度（P=0.01）高于飼喂1.0%EB的母牛。隨著EB處理量的增加，異丁酸濃度和溶解的H2呈二次方下降趨勢（P=0.09）。氨氮濃度呈二次方趨勢（P=0.01），0.5%EB最初會降低NH3-N濃度，但對照組與1.0%和2.0%EB之間沒有差異。

表4：飼喂以大麥青貯料為基礎日糧，增加添加強化生物炭的小母牛原生動物數量和瘤胃pH

原生動物總計數呈二次下降（P<0.01），對照組的總計數高于所有濃度的EB（表4）。不同處理中Entodinium、Holotrichs和其他原生動物屬的百分比沒有差異（P>0.14）。當EB增加2.0%時，pH值的最小值和變化值呈二次方趨勢（P<0.06）,最小的pH值和減少的pH值變化。