3.草氨酸對正常和高血糖NRK-52E培養細胞呼吸的影響

圖3：經100mM草氨酸處理或未經100mM草氨酸處理的對照細胞和高血糖細胞培養物的呼吸參數。對基礎呼吸、ATP鏈接呼吸、泄漏呼吸和最大呼吸進行了測定。單用高血糖條件和草氨酸處理對所有測量參數的影響都是遞減的，而在高血糖條件下用草氨酸處理細胞可顯著增加所有呼吸參數（p<0.0001）。

為了評估在高血糖培養中誘導的新陳代謝以及草氨酸處理后無氧代謝的減少是否與NRK-52E細胞耗氧量的變化有關：測量了基礎呼吸、ATP鏈接呼吸、泄漏呼吸和最大呼吸。高血糖條件下的NRK-52E細胞和草酸鹽處理本身都不會對呼吸參數產生影響。而高血糖條件和草氨酸處理的結合則顯著增加了所有呼吸參數（p<0.0001）（圖3）。

4.草氨酸對正常和高血糖NRK-52E培養細胞中mRNA表達的影響

圖4：控制和未處理草氨酸的高血糖細胞培養物中LDH、PDH、SDH、HO-1和VEGF的mRNA表達。雖然LDH、PDH和SDH的表達有所升高，但未達到顯著水平。草氨酸可明顯提高兩組中血管內皮生長因子的表達。HO-1的表達也有類似趨勢，但未達到顯著水平。

為了了解代謝和呼吸的變化是如何發生的，我們檢測了關鍵酶的mRNA表達水平，發現LDH、丙酮酸脫氫酶（PDH）和琥珀酸脫氫酶（SDH）的表達幾乎不受高血糖培養條件的影響。另一方面，草氨酸處理會增加正常和高血糖NRK-52E細胞培養物中所有基因的表達，但并不顯著（圖4A-C）。在正常和高血糖的NRK-52E細胞中，草酸鹽處理和未處理的NRK-52E細胞中血管內皮生長因子的表達均有明顯變化（p=0.0004）（圖4D），血紅素氧合酶-1（HO-1）標記物的表達也有同樣的趨勢（圖4E）。

討論：

本研究的主要發現是，在高血糖條件下，NRK-52E細胞經草氨酸處理后，新陳代謝完全改道。這似乎導致了基礎和最大呼吸能力的提高以及乳酸生成的減少。乳酸鹽的產生與氧化還原平衡密切相關，即與細胞膜NAD+/NADH平衡密切相關。有趣的是，乳酸鹽生成量的主要變化受高血糖條件的影響，而氧化還原平衡（NAD+/NADH比率）、細胞活力和增殖則受草酸鹽處理的影響。這表明乳酸脫氫酶LDH抑制確實會導致NAD+/NADH比率發生巨大變化，進而引導NRK-52E細胞增加氧化磷酸化（圖5）。這些發現與高度糖酵解細胞的報告一致，在高度糖酵解細胞中，草氨酸已被證明能將糖酵解通量轉向氧化磷酸化，即把沃伯格代謝表型（即使在有足夠氧氣維持氧化磷酸化的情況下，乳酸鹽的產生也會增加）轉變為巴斯德代謝表型。

有趣的是，最近的研究結果表明，糖尿病小鼠代謝通量的增加具有保護腎臟的作用，特別是與PKM2激活有關。

此外，我們的研究表明，LDH抑制可能是提高近端腎小管細胞氧化能力的一個新的治療靶點。但值得注意的是，在高血糖NRK-52E中進行草氨酸處理會顯著降低細胞的生長和增殖。

在一些癌細胞系中，草氨酸被證明能以劑量依賴的方式誘導細胞凋亡，而其他癌細胞系對細胞凋亡的誘導作用則微乎其微，有鑒于此，我們使用了相對高濃度的草氨酸，在分析時所有細胞培養物的存活率都超過了50%。細胞生長和增殖的減少可能是誘導細胞凋亡的結合，以及草酸鹽將糖酵解通量重新定向到有氧途徑并進一步降低NAD+量的事實，如測量的NAD+/NADH比率所示。之前對糖尿病大鼠和患者的研究報告支持將高血糖驅動的假缺氧與缺氧條件下的預后惡化聯系起來，這同樣加劇了NAD+的缺乏。

在正常和高血糖條件下的NRK-52E中，草氨酸處理可誘導平行和相似的細胞形態和增殖變化，這可能源于NAD+/NADH比值的改變，損害了代謝通量，最終導致細胞活力喪失。細胞質NAD+的消耗高達50%，這與細胞新陳代謝和活力的類似紊亂有關。

NRK-52E細胞中與高血糖條件相關的假缺氧表型本身并不會激活細胞的缺氧反應，如血管內皮生長因子（VEGF）的表達，它受缺氧誘導因子（HIF）的調節，而缺氧與HIF激活后VEGF表達的增加有關。這共同表明，草氨酸能重新激活血管內皮生長因子對氧的依賴性敏感性，而這種敏感性之前已在高血糖培養條件下喪失，因此產生了一種類似于缺氧表型的表型。有趣的是，其他與HIF相關的酶，如SDH和HO-1沒有或幾乎沒有反應。原因可能是與最近報道的保護性HIF激活不同，HO-1和血管內皮生長因子在HIF激活后都增加了，從而改善了糖尿病大鼠的腎臟預后。LDH和/或PDH的表達不太可能驅動糖酵解表型，因為LDH的抑制與乳酸產生的變化有關。

乳酸是葡萄糖生成的主要底物，因此以往的研究能夠描述與抑制肝臟和腎臟葡萄糖生成相關的NADH:NAD+比率的變化。營養水平會調節丙酮酸羧化酶（PC）的活性（PC是糖元生成的第一步），因此饑餓會導致PC活性升高。草酸鹽的脫靶效應包括PC，通過非競爭性和非競爭性抑制。有趣的是，在非饑餓條件下，只看到極少的非加速PC活性，因此PC受抑制不太可能是我們的研究中出現的表型的主要原因，但在PC活躍的情況下，這仍然是一個未決問題，因此需要進一步的研究來回答這個問題。

我們的研究結果表明，在高血糖條件下培養的NRK-52E細胞可通過抑制乳酸脫氫酶LDH增加有氧糖酵解。這就抵消了高血糖培養條件下誘導的代償性無氧糖酵解。這種新陳代謝重編程的潛在機制可能來自于與HIF通路相關的氧化還原平衡和新陳代謝適應的改變，從而消除了NRK-52E細胞中高血糖條件的HIF抑制特性。這些發現支持了進一步研究新型LDH抑制劑以防治糖尿病相關腎病的必要性。