摘要:

糖尿病腎病（DKD）與代謝模式的改變有關(guān)，即使在氧氣供應(yīng)充足的情況下，也會導(dǎo)致乳酸生成增加。研究表明，高血糖是決定DKD發(fā)展的一個重要因素。在此，我們探討了在高血糖條件下，乳酸脫氫酶（LDH）抑制劑草酸鹽對離體大鼠腎近曲小管細(xì)胞（NRK-52E）產(chǎn)生的代謝影響。在1T NMR系統(tǒng)中，用超極化[1-13C]丙酮酸在高D-葡萄糖（25mM）負(fù)荷下或不在高D-葡萄糖（25mM）負(fù)荷下對草氨酸（100mM）處理24小時的細(xì)胞進行了研究。使用氧氣微電極系統(tǒng)進行了呼吸測量。在存在或不存在高D-葡萄糖的情況下，對細(xì)胞進行草氨酸處理可分別減少乳酸產(chǎn)生/積累36.5%或22.5%。研究發(fā)現(xiàn)，NRK-52E細(xì)胞的增殖減少、肥大效應(yīng)以及血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）表達升高。在用草氨酸處理高D-葡萄糖培養(yǎng)的NRK-52E細(xì)胞時，糖酵解通量的增加導(dǎo)致細(xì)胞耗氧率的上調(diào)。我們的研究結(jié)果表明，暴露于高血糖條件下的體外培養(yǎng)NRK-52E細(xì)胞可通過抑制LDH使糖酵解通量轉(zhuǎn)向氧化磷酸化。有氧代謝和無氧代謝之間的這種聯(lián)系可能取決于氧化還原平衡（NAD+/NADH比率）。總之，高血糖條件和草酸鹽處理會改變NRK-52E細(xì)胞的代謝表型，使其在NAD+/NADH比值降低的介導(dǎo)下增加氧的利用，進而降低細(xì)胞的增殖/存活率。

引言：

糖尿病（DM）是慢性腎病（CKD）和終末期腎病（ERSD）的主要病因。越來越多的證據(jù)表明，腎小管間質(zhì)空間的變化是導(dǎo)致DKD的主要決定因素。近端腎小管占外腎皮質(zhì)的90%，約占整個腎臟質(zhì)量的50%。在DKD的發(fā)展過程中，腎臟在葡萄糖穩(wěn)態(tài)中的關(guān)鍵作用非常重要，其中包括葡萄糖生成、葡萄糖濾過、葡萄糖重吸收和葡萄糖消耗過程。眾所周知，糖酵解和氧化磷酸化等ATP生成途徑在細(xì)胞生命周期中舉足輕重，因此也是包括DKD在內(nèi)的腎臟疾病進展的關(guān)鍵組成部分。有趣的是，新的報告顯示，激活丙酮酸激酶M2（PKM2）可增加糖酵解通量，從而在糖尿病嚙齒動物模型中產(chǎn)生腎保護作用。然而，人們對與高血糖相關(guān)的糖酵解適應(yīng)性及其對糖尿病腎臟病理生理學(xué)中細(xì)胞模式改變的貢獻仍然知之甚少。高血糖的后果不僅會改變糖酵解通量，還會改變耗氧量，從而導(dǎo)致缺氧。缺氧是DKD發(fā)生和發(fā)展的早期事件，而占腎耗氧量80%的近端腎小管尤其容易缺氧。

缺氧不可避免地會增加乳酸的產(chǎn)生，但卻犧牲了對能量更有利的氧化磷酸化。另一方面，已證明高血糖會誘發(fā)一種變異的缺氧，即假性缺氧。高血糖會導(dǎo)致多元醇通路通量增加；高級糖化終產(chǎn)物（AGE）形成增加；蛋白激酶C（PKC）同工酶活化；和己二胺通路通量增加--最終導(dǎo)致NADH/NAD+比率升高和乳酸鹽產(chǎn)生。在此，我們推測，如果LDH表達或乳酸鹽生成的增加在高葡萄糖誘導(dǎo)的近端小管細(xì)胞代謝重編程中起著關(guān)鍵作用。那么是否有可能使用LDH抑制劑草氨酸直接靶向LDH酶？

草氨酸是丙酮酸的同種異構(gòu)電子類似物，也是一種著名的LDH抑制劑。由于草氨酸在腫瘤細(xì)胞的沃伯格效應(yīng)中起到阻礙LDH-M的作用，長期以來一直備受研究關(guān)注，最近又被證實能改善糖尿病小鼠的胰島素敏感性。1H和/或13C NMR光譜法可量化穩(wěn)態(tài)代謝物濃度，但受靈敏度限制，掃描實驗時間較長，且難以轉(zhuǎn)化為體內(nèi)條件。超極化13C NMR是一種補充技術(shù)，能以足夠的靈敏度評估代謝通量，甚至能繪制體內(nèi)快速代謝過程圖，從而將該方法直接應(yīng)用于體內(nèi)情況。為了研究草酸鹽補充劑對高血糖和LDH抑制的影響，我們在此使用了超極化[1-13C]丙酮酸NMR光譜和呼吸測定法。

材料與方法：

細(xì)胞培養(yǎng)：

NRK-52E細(xì)胞是一種大鼠腎上皮細(xì)胞系，NRK-52E細(xì)胞在含低糖的Dulbeccos改良老鷹培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基補充有10%的胎牛血清、10單位/毫升青霉素和10毫克/毫升鏈霉素。細(xì)胞數(shù)量和活力通過胰藍排除試驗測定。每隔兩天或三天更換一次生長培養(yǎng)基，并對細(xì)胞進行亞培養(yǎng)，直到菌落匯合度達到80%時再做進一步測定。在所有細(xì)胞實驗中，共準(zhǔn)備了四組細(xì)胞，一組未經(jīng)處理，一組用25mM D-葡萄糖處理24小時，一組用100mM草氨酸處理24小時，一組用25mM D-葡萄糖和-100mM草氨酸處理24小時。

呼吸測定法：

37°C下，在帶有O2電極的封閉式Unisense微呼吸室（UnisenseA/S，丹麥奧胡斯）中測量耗氧量。每次實驗使用1000萬個懸浮的NRK-52E細(xì)胞。在進行微呼吸測量前，用鑷子夾取NRK-52E細(xì)胞并在DMEM緩沖液中重懸。測量開始前，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到密閉室并讓其穩(wěn)定5分鐘。在5μM Oligomycin的存在下抑制ATP合酶。最大呼吸能力是在解偶聯(lián)劑間氯苯基甲酰氰腙（CCCP）滴定步驟的存在下測量的。加入羅替酮（1μM）和抗霉素A（5μM）以完全關(guān)閉氧化磷酸化。由此產(chǎn)生的呼吸作用來自非半胱氨酸氧消耗過程。