摘要：

膠質母細胞瘤（GBM）是最常見的原發性惡性腦腫瘤。分子氫被認為是包括癌癥在內的多種疾病的預防和治療氣體。在我們的研究中，我們試圖評估分子氫對GBM的潛在作用。使用大鼠正位膠質瘤模型和小鼠皮下異種移植模型進行體內研究。動物每天吸入氫氣（67%）1小時，共兩次。核磁共振成像研究用于確定腫瘤體積。通過免疫組織化學（IHC）、免疫熒光染色和流式細胞術分析來確定表面標記物的表達。進行球形成試驗以評估癌癥干細胞的自我更新能力。還進行了細胞遷移、侵襲和集落形成試驗。體內研究表明，吸入氫氣能有效抑制GBM腫瘤的生長，延長GBM小鼠的生存期。IHC和免疫熒光染色表明，氫氣處理可明顯下調干性（CD133、Nestin）、增殖（ki67）和血管生成（CD34）標志物的表達，同時還可上調分化標志物GFAP的表達。體外研究也得到了類似的結果。氫處理還抑制了膠質瘤細胞的成球能力。此外，氫處理還抑制了膠質瘤細胞的遷移、侵襲和集落形成能力。這些結果表明，分子氫可作為一種潛在的抗腫瘤藥物，用于治療腦膠質瘤。

引言：

膠質母細胞瘤（GBM）是最常見的原發性惡性腦腫瘤，其特點是增殖迅速、向正常腦組織擴散性侵襲、化療抵抗力強。目前治療GBM的標準方法是最大限度切除腫瘤，然后進行放療，并同時輔助替莫唑胺。GBM的侵襲性是根治性治療的主要障礙，因為它使手術完全切除成為不可能，并導致治療后腫瘤復發。盡管多年來一直在研究GBM的潛在新療法，但目前的治療策略仍不足以控制病情，1年相對生存率為37.4%，5年生存率為4.9%。因此，開發治療GBM的新方法尤為重要。

自Ohsawa等人報道吸入1-4%的氫氣可明顯縮小大鼠腦梗塞的大小以來，分子氫就被認為是一種預防和治療性醫用氣體。目前，已有170多種不同的人類和動物疾病模型證明了氫的潛在益處。最近，分子氫對癌癥的影響引起了人們的極大關注。1975年，Dole等人在《科學》雜志上首次報道了氫氣對皮膚鱗狀細胞癌的治療作用。他們發現，在總壓為8個大氣壓的條件下，用97.5%的氫氣對小鼠進行為期2周的高壓氧治療，可明顯誘導腫瘤消退。由于高壓氫氣治療的特殊條件，隨后關于氫氣抗癌作用的研究一直停滯不前，直到2007年Ohsawa等人報道了低濃度氫氣的生物效應。幾年后，Saitoh等人報道了中性pH值的富氫電解水（NHE水）可在體外細胞模型中達到抑制腫瘤生長和腫瘤侵襲的效果。隨后的體外研究表明，分子氫可抑制癌細胞增殖、遷移、侵襲和集落形成，并誘導癌細胞凋亡。一些體內研究表明，分子氫可以防止癌變，抑制癌癥進展，減輕化療或放療的副作用，增強化療藥物的抗腫瘤作用。雖然分子氫已在癌癥治療領域顯示出潛力，但其抗癌特性僅限于少數幾種腫瘤類型，其潛在的分子機制仍有待確定。

在本研究中，我們探討了分子氫對GBM的可能治療作用。我們使用體內和體外實驗模型來評估分子氫的潛在作用。我們還研究了氫氣作用的機制。

材料與方法：

動物和腫瘤細胞系：

雄性Wistar大鼠（8周齡，體重170-180克）和雌性BALB/c裸鼠（8周齡，體重20-24克）。動物飼養在22°C-25°C、12小時光-暗周期的標準條件下，以正常飲食喂養。

大鼠C6腦膠質瘤細胞和人類U87細胞來自美國類型細胞收集中心。細胞在5%CO2和37°C的DMEM/F12培養基中常規培養，培養基中添加10%胎牛血清和1%青霉素和鏈霉素。

大鼠C6腦膠質瘤模型：

實驗前大鼠禁食1天。然后腹腔注射10%水合氯醛（3mL/kg）進行麻醉，并固定在立體定向裝置中。然后用手術剪在顱骨中線切開頭皮皮膚。然后，在顱骨前囟門后1毫米、矢狀縫外側3毫米處開孔。將帶有微型注射器的30號針頭插入距顱骨表面7毫米的深度，立體注射10μL磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中的C6膠質瘤細胞（1×106）。注射過程持續10分鐘，然后將針頭固定在原位5分鐘，再逐漸抽出3分鐘，以防止溶液倒流。植入神經膠質瘤細胞后，大鼠被隨機分為兩組，包括氫氣吸入組（HI）和對照組（CTRL）。

小鼠U87皮下模型：

BALB/c裸鼠皮下注射1×106個存活的U87細胞。注射后，小鼠被隨機分為兩組，包括氫氣吸入組（HI）和對照組（CTRL）。腫瘤體積每周測量一次，計算公式如下：體積=寬度2×長度×0.4。

吸入氫氣：

將一個透明的密閉箱（20cm×18cm×15cm）連接到氫氧霧化器，該霧化器產生67%的H2和33%的O2（V/V）。在大鼠C6膠質瘤或小鼠U87皮下模型建立的第二天開始進行氫氣處理，直至實驗結束。將小鼠置于氫氣箱中，每天吸入混合氣體兩次，每次1小時。在吸入過程中，小鼠保持清醒并自由活動。使用熱痕量GC超氣相色譜法監測封閉箱中的氫氣濃度。