3.2.吸水鏈霉菌5008培養過程中的pH變化

在5008的正常情況下，發酵液pH逐漸上升。在發酵早期，pH上升緩慢，然后迅速上升直至達到峰值并趨于穩定（圖3）。發酵液的pH是微生物發酵的綜合結果。Val-A可以與氫離子結合，導致發酵液中氫氧根離子比例上升(Bai et al.,2006)。因此，在發酵后期，當Val-A大量合成時pH上升。在pH沖擊組中，菌絲體首先自然培養20小時，并在pH 8.0時進行堿性pH沖擊。然后，pH在短時間內迅速下降，這是由脅迫響應引起的。最終，pH在60小時后恢復，用于后續發酵。此外，Val-A在酸性條件(pH<5.0)下可被水解(Jin et al.,2006)，因此發酵pH的升高也有利于Val-A的積累和穩定。

胞內pH對于微生物的生長和代謝至關重要，它可以影響營養物質的吸收和利用、蛋白質合成、線粒體呼吸、碳水化合物代謝和其他重要的生命活動(Cotter et al.,2001)。因此，只有維持胞內pH的穩定，才能保證微生物的正常生長和代謝。如圖3所示，在整個發酵過程中，胞內pH略有上升，從開始的7.21到最后7.73。Corvini等人(Corvini et al.,2004)也使用BCECF-AM熒光探針測定普拉特鏈霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)的胞內pH，其范圍在6.5至8.5之間。還發現基因SHJG7463編碼

陽離子轉運ATP酶在DNA微陣列中高表達，表明陽離子轉運加速以中和pH的變化。此外，將氫離子轉運進出細胞膜會消耗大量ATP，這也解釋了下面關于菌絲體呼吸活性的現象。另外，應該注意的是，三羧酸循環導致胞外pH上升，而糖酵解和谷氨酸的合成通常導致酸化。因此，pH沖擊組中的pH波動可能是碳水化合物和氨基酸代謝快速消耗的綜合結果。

3.3.pH沖擊引起的基因表達全局變化

使用倍數變化2且p<0.5的統計標準，在菌株5008中共鑒定出146個pH沖擊下的差異表達基因(DEGs)（表1）。pH沖擊下顯著差異表達的基因主要分配于代謝、細胞過程和信號傳導以及信息儲存和處理相關的功能。正如預期的那樣，除糖基轉移酶基因valG外，大多數Val-A生物合成基因的轉錄水平在pH沖擊下均增強。

在代謝相關的DEGs中，基因SHJG7463編碼細胞膜上的陽離子轉運ATP酶。這些基因的上調表達表明鏈霉菌細胞中的轉運蛋白能夠及時響應pH沖擊，這有利于營養物質的吸收和次級代謝產物的分泌，并且相關的陽離子轉運蛋白基因與鏈霉菌發酵過程中的pH變化和呼吸鏈密切相關。編碼谷氨酰胺合成酶的SHJG3702上調。這與Gu的研究一致，該研究證明谷氨酰胺和3-氨基-5-羥基苯甲酸可以顯著提高Val-A的產量，并且谷氨酰胺合成酶活性與Val-A產量呈正相關。另一個DEG SHJG6704編碼銨通透酶。Xia(Xia and Jiao,1986)發現，在Val-A合成過程中添加銨離子可以通過加速氮代謝來促進細胞生長。SHJG6704的上調表達為Val-A提供了更多的氮源，并促進了細胞生長。SHJG0557編碼細胞色素bd型醌氧化酶。SHJG7814編碼糞卟啉原III氧化酶和相關的Fe-S氧化還原酶。鐵硫氧化還原酶、細胞色素和鐵硫蛋白是細胞電子呼吸鏈的組成部分。SHJG0557和SHJG7814的上調表達意味著吸水鏈霉菌5008的呼吸發生變化，這是pH沖擊的響應措施之一。

在細胞過程和信號轉導相關的DEGs中，編碼UDP-N-乙酰胞壁酸脫氫酶的基因SHJG3272上調了2.99倍，而編碼細胞分裂蛋白FtsI/青霉素結合蛋白2的基因SHJG3894和SHJG3896以及幾個細胞壁水解酶基因則下調。這些基因與細胞壁合成有關，表明在pH沖擊下細胞壁合成過程得到加強。

在信息儲存和處理相關的DEGs中，大部分是轉錄調控因子，它們在次級代謝產物合成的調控中發揮作用，也表明吸水鏈霉菌5008通過復雜的信號轉導系統響應pH沖擊。原核生物的基因轉錄需要由核心酶和σ因子組成的RNA聚合酶。核心酶由α2ββ'ω等亞基組成。編碼RNA聚合酶ECF亞家族σ因子的基因SHJG6022顯著上調。在天藍色鏈霉菌中，雙組分調控系統CseB/CseC影響σE的活性(Paget et al.,2002)。環境脅迫信號由雙組分系統傳導。該系統與σE的啟動子結合，然后通過與核心酶的相互作用激活轉錄。因此，推測雙組分系統和σE的相互作用也可能參與吸水鏈霉菌5008，可以傳遞pH脅迫信號并調控參與Val-A生物合成的基因的表達。

簡而言之，這些DEGs主要與氨基酸代謝、細胞過程和信號轉導以及信息儲存和處理相關。此外，通過qRT-PCR分析驗證了關鍵基因的動態變化。在轉錄變化方面，DNA微陣列和qRT-PCR分析之間顯示出良好的一致性，表明了微陣列數據的可靠性。可以推測，在胞外pH沖擊下，細胞壁接收到的脅迫信號通過雙組分系統進行轉導。然后由雙組分系統調控的ECFσ因子將與核心酶一起作用于下游基因并激活細胞防御系統。最終，營養物質和離子轉運加速，導致葡萄糖代謝、氨基酸代謝、呼吸鏈和其他生理活動的變化，同時也緩解了堿刺激并促進了Val-A的生物合成。

3.4.Val-A發酵過程中呼吸活性的變化

如圖4所示，兩種策略下的菌絲體呼吸活性在接種后均下降，這可能歸因于程序性細胞死亡。36小時后，由于蛋白質快速合成和細胞積累增多，pH沖擊組的呼吸活性持續增加12小時，然后開始下降。微生物呼吸鏈成分的基礎是NAD、FAD、FAM、鐵硫蛋白(Fe-S)、泛醌（輔酶Q）和細胞色素系統。基因SHJG0557編碼細胞色素BD氧化酶，SHJG7814編碼鐵硫氧化還原酶，這些酶是呼吸鏈的基本組成部分。可以推測，在pH沖擊后，呼吸電子傳遞鏈中的酶活性增強，因此電子傳遞和呼吸加速以產生更多能量，這對Val-A合成至關重要。

3.5.pH沖擊對氮代謝的影響

圖5.pH沖擊后5008的氮同化途徑和胞內游離谷氨酸的變化。

先前的研究報道，通過使用氮同位素標記方法，谷氨酸可能是氮橋的主要來源(Mahmud et al.,1999)。根據Hodgson的報告(Hodgson,2000)和KEGG，吸水鏈霉菌5008的氮同化途徑如圖5所示。當氮源充足時，銨被谷氨酸脫氫酶催化成谷氨酸。當缺乏氮源時，銨主要被谷氨酰胺合成酶(GS)催化成谷氨酰胺，然后谷氨酰胺轉化為谷氨酸。谷氨酰胺和谷氨酸都參與了Val-A生物合成的一系列反應過程。微陣列和qRT-PCR的結果表明，基因SHJG3702和SHJG6704均上調。隨后，我們發現pH沖擊組胞內谷氨酸濃度是對照組的2.82倍（圖5），表明在pH沖擊下銨離子轉運加速，從而產生更多的谷氨酰胺和谷氨酸。顯然，細胞處于相對高氮的環境中，而Val-A合成正在進行中，因此更多的氮前體（谷氨酸）有利于Val-A的合成。此外，以往在多種微生物中的研究表明，輸入的肽可分解為游離氨基酸，形成重要的質子來源(Giotis et al.,2010)。谷氨酸是酸性氨基酸，增加的谷氨酸除了提供氮源外，還可以緩解堿的壓力。

4.結論

堿性pH沖擊顯著提高了Val-A的產量27.43%。結合DNA微陣列，研究了其對細胞呼吸活性和細胞內微環境的影響，揭示了鏈霉菌對pH沖擊的細胞響應機制（圖6）。pH沖擊加速了質子轉運并增強了細胞的呼吸活性，從而為細胞生長提供了更多能量。而這一過程中酸性氨基酸的形成為有效霉素的合成提供了更多的氮前體。因此，上述因素的共同作用提高了Val-A的產量。顯然，在鏈霉菌發酵中應更加重視堿性pH沖擊。

致謝

本研究得到浙江省公益性項目(2016C32007)、國家重點研發計劃項目(2016YFD0401201)、浙江省科協青年人才培育項目(2016YCGC004)和國家自然科學基金(20906060)的資助。