2.4.胞外和胞內pH測量

胞外pH(pHex,培養基pH)使用pH微電極計(Unisense,Denmark)測量。

胞內pH(pHi)使用pH敏感染料2',7'-雙-(2-羧乙基)-5-(和-6)-羧基熒光素乙酰氧基甲酯(2',7'-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester,BCECF-AM；碧云天生物技術研究所，中國江蘇)進行測量。本研究采用雙激發比率法，使用多掃描光譜儀(SpectraMax M5,CA,USA)；激發波長分別為440nm和488nm，發射波長為535 nm。使用離子載體尼日利亞菌素(nigericin,Sigma,Lezennes,France)和一組pH值在6.5至8.5之間的確定pH的高K?磷酸鹽緩沖液進行體內校準(Corvini et al.,2000)。

2.5.DNA微陣列實驗和微陣列數據分析

使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN,Hidden,Germany)按照制造商的說明分離和純化總RNA，并使用安捷倫2100生物分析儀系統(Agilent,CA,USA)檢查其質量和數量。總RNA使用Low Input Quick Amp Labeling Kit,One-Color進行擴增和標記。Cy3標記的cRNA使用RNeasy Mini Kit進行純化。在雜交爐(Hybridization Oven)中雜交17小時。雜交后，使用Gene Expression Wash Buffer Kit清洗芯片，并使用安捷倫微陣列掃描儀G2565CA掃描微陣列。

使用Feature Extraction Software 10.7對陣列圖像進行采集和量化，并使用Quantile算法對原始數據進行歸一化。計算每個基因的歸一化表達比率，并使用倍數變化

2.0和p<.05的標準進行顯著性檢驗。統計檢驗(t檢驗)中p值最低的變化值被視為最可靠的。為了表示每種培養條件下三個重復測量值（每個有一個技術重復）的變異，計算了變異系數(CV)。在樣品中，至少98%的基因組產生可檢測的轉錄本，平均變異系數不超過0.15，符合安捷倫的質量控制建議。

2.6.通過定量實時RT-PCR驗證微陣列數據

使用Trizol(Invitrogen,CA,USA)提取總RNA，并用gDNA Eraser(Takara,Dalian,China)處理。隨后，使用PrimeScriptTM RT reagent Kit(Takara,Dalian,China)進行反轉錄。使用SYBR Premix Ex TaqTM(Ti RNaseH Plus)(Takara,Dalian,China)在StepOne Real-Time PCR(Applied Biosystems)上測定基因的轉錄水平。PCR條件為：95°C預變性10分鐘，然后在95°C變性15秒，58°C退火60秒，72°C延伸15秒，共40個循環。對于每個基因，種子階段的發酵樣品被定義為表達水平1.0，結果表示為相對于對照樣品mRNA水平的倍數增加(Feng et al.,2016)。

2.7.胞內游離谷氨酸濃度的測定

使用HPLC，采用茚三酮比色法測定在37°C(220 rpm)下培養兩天的菌株5008的胞內游離谷氨酸。從發酵培養基中不同時間點取出的生物量樣品在12,000g下離心5分鐘，洗滌兩次，重懸于1 mL ddH?O中，并在冰浴中超聲破碎（20個循環，每次超聲5秒，間隔10秒）。在9000g下離心10分鐘去除細胞碎片，然后將上清液與10%磺基水楊酸混合，在-20°C下放置20分鐘，并在12,000g下離心60分鐘。然后，提取物蒸發，用1mL 0.02 mol/L HCl重懸，并用0.22μm水相濾膜過濾(Wu et al.,2012)。將每種樣品20μL注入HPLC進行谷氨酸測定。

2.8.CTC染色

5-氰基-2,3-二對甲苯基四氮唑氯化物(5-cyano-2,3-ditolyl-tetrazolium chloride,CTC)是一種可溶且不發熒光的染色劑。它可被呼吸細胞的電子傳遞鏈吸附并還原成不溶的紅色熒光物質(CTC formazan)，并在細胞內積累。因此，這種氧化還原染料已被廣泛用于測定細菌的呼吸活性。熒光強度越高代表呼吸活性越高。將菌絲體從搖瓶中在12,000g下離心5分鐘收集，洗滌兩次并重懸于鹽水(0.9%NaCl)中。使用Bacstain-CTC快速染色試劑盒(Dojindo,Kumamoto,Japan)在1.5 mL離心管中按照說明書進行CTC染色，在37°C染色30分鐘(Winding et al.,1994)。將200μL染色樣品置于96孔板中，在激發波長488 nm、發射波長620 nm至640 nm下使用多掃描光譜儀(SpectraMax M5,CA,USA)進行測量。

3.結果與討論

3.1.pH沖擊對Val-A產量和細菌生長的影響

在初步篩選pH后，pH沖擊在8.0時效果最佳。分別向發酵液中加入三種常見的堿液。發現兩種有效的添加劑氫氧化鈉和氨水，而磷酸鹽緩沖液則具有相反的效果（圖1a）。這與一些文獻報道一致，這些文獻記載過量的無機磷酸鹽通常會抑制次級代謝產物的生產(Sola et al.,2003)。因此，所得結果表明pH沖擊有利于Val-A的生產。氫氧化鈉組的Val-A產量最高，因此選擇氫氧化鈉用于進一步研究。關于pH沖擊的合適時間點，選擇4 h-24 h內的5個時間點作為最旺盛的時期（圖1b）。當堿性沖擊時間晚于24小時時，該處理對Val-A產量沒有顯著影響，圖中未顯示。很明顯，第20小時是pH沖擊的最佳時間。在4 h-12 h加入氫氧化鈉時，細胞仍處于生長早期，堿液的刺激在一定程度上阻礙了細胞的生長，因此pH沖擊沒有明顯效果，甚至降低了Val-A的產量。至于不同的處理次數，發現多次pH沖擊的效果未達預期（圖1c）。在Val-A合成過程中，發酵液的pH會持續上升，這使得多次pH沖擊的效果不如單次pH沖擊顯著。總之，最佳條件是在第20小時向發酵液中加入氫氧化鈉溶液，而過多的無機磷酸鹽對Val-A生產有阻礙作用。

pH沖擊對吸水鏈霉菌5008的細胞重量有顯著影響，在96小時時從6.00 g/L增加到6.60 g/L（圖2）。發酵24小時后，pH沖擊組的細胞積累量更高，并且pH沖擊組的細胞生長速率快于對照組。這一現象表明pH刺激了鏈霉菌的代謝，在一定程度上加速了其生長，同時伴隨著Val-A的大量合成，產量提高了27.43%。在第四天，pH沖擊組的Val-A產量和產率（13.29 g/L;2.01 g/g蛋白）均高于對照組（10.78 g/L;1.80 g/g蛋白）（圖1c和圖2）。可以推測前體在發酵早期積累，然后這些前體被用于合成Val-A。Val-A產量的增加是生物量增加和產物增加的共同作用結果。

糖的消耗反映了鏈霉菌的能量代謝。Val-A合成的碳源前體是磷酸戊糖途徑上的景天庚酮糖-7-磷酸(Degwert et al.,1987;Toyokuni et al.,1987)。pH沖擊組第一天的糖消耗速率[2.23 g/(L·h)]快于對照組[1.91 g/(L·h)]，并且pH沖擊組的細胞代謝活性相對較高（圖2）。這主要是由于堿刺激使細胞加速利用碳水化合物產生酸以恢復pH。此外，發酵液中糖的消耗為細胞生長提供了能量，這與生物量的增加相一致。