熱線(xiàn):021-66110810,66110819
手機(jī):13564362870
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摘要
有效霉素A(Val-A)是鏈霉菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物,在控制水稻紋枯病、稻曲病和猝倒病方面具有廣泛的農(nóng)業(yè)應(yīng)用價(jià)值。本研究探討了堿性pH沖擊對(duì)增強(qiáng)Val-A產(chǎn)量的影響及其機(jī)制。通過(guò)一次或多次NaOH沖擊處理,結(jié)合更快的蛋白質(zhì)合成和糖消耗,實(shí)現(xiàn)了更高的Val-A產(chǎn)量;堿性pH沖擊可使Val-A產(chǎn)量提高27.43%。與氨基酸代謝、碳代謝和電子呼吸鏈相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄顯著上調(diào),同時(shí)伴隨著呼吸活性和谷氨酸濃度的大幅增加。Val-A的產(chǎn)量受到一系列復(fù)雜機(jī)制的促進(jìn),并響應(yīng)pH脅迫信號(hào),這導(dǎo)致了谷氨酸代謝和呼吸活性的增強(qiáng)。所獲得的信息將有助于未來(lái)抗生素產(chǎn)量提高的研究以及分子機(jī)制的深入揭示。
1.引言
抗真菌抗生素有效霉素A(Val-A)由工業(yè)菌株吸水鏈霉菌5008(Streptomyces hygroscopicus 5008)發(fā)酵產(chǎn)生,在東亞已被廣泛用作控制水稻紋枯病、稻曲病和猝倒病的首要藥劑。提高Val-A產(chǎn)量的研究備受關(guān)注,但似乎對(duì)提高生產(chǎn)效率作用有限。pH是微生物代謝的綜合反映,從而影響發(fā)酵過(guò)程和細(xì)胞生長(zhǎng)。pH可以影響代謝方向,不同階段生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成的最適pH也不同。相同的微生物在不同的環(huán)境pH條件下可能產(chǎn)生不同的代謝產(chǎn)物。例如,在pH 2-3條件下,黑曲霉(Aspergillus niger)發(fā)酵蔗糖的主要產(chǎn)物是檸檬酸,但當(dāng)pH變?yōu)?時(shí),主要產(chǎn)物是草酸(Lu et al.,2016)。因此,在發(fā)酵過(guò)程中,采用適當(dāng)?shù)牟呗钥刂苝H可以獲得所需的產(chǎn)品。
發(fā)酵pH對(duì)鏈霉菌的發(fā)酵也有很大影響,其中一些鏈霉菌具有特定的響應(yīng)措施。不同抗生素的合成需要不同的pH,即使是同一種抗生素,在不同的培養(yǎng)階段也需要不同的pH才能獲得最高產(chǎn)量。根據(jù)Chan的研究(Chan et al.,2015),提出了一種兩階段pH控制策略,即在培養(yǎng)112小時(shí)后將培養(yǎng)pH從5.5調(diào)整到5.8,以提高恩拉霉素(enduracidin)的產(chǎn)量,生產(chǎn)效率提高了51.2%。再例如,通過(guò)基于原位pH監(jiān)測(cè)的種子階段優(yōu)化,ε-聚-L-賴(lài)氨酸的產(chǎn)量最多提高了36.6%(Sun et al.,2015;Xu et al.,2015)。
環(huán)境脅迫一直是促進(jìn)鏈霉菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的關(guān)鍵方法,環(huán)境信號(hào)可以通過(guò)啟動(dòng)復(fù)雜的轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)來(lái)提高次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量(Li et al.,2016)。鏈霉菌基于不同類(lèi)型的環(huán)境因素,具有許多獨(dú)特的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。在天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)(Streptomyces coelicolor A3(2))中,pH沖擊誘導(dǎo)了放線(xiàn)紫紅素(actinorhodin)生產(chǎn)的調(diào)控基因和生物合成基因的過(guò)表達(dá)(Kim et al.,2007,2008)。此外,在鏈霉菌sp.CK4412(Streptomyces sp.CK4412)中,推定的酸沖擊誘導(dǎo)基因SCO7832的表達(dá)通過(guò)途徑特異性調(diào)控基因的過(guò)表達(dá)刺激了tautomycetin的生產(chǎn)(Park et al.,2009)。此外,雙組分調(diào)控系統(tǒng)也是一種非常重要的調(diào)控方式。據(jù)報(bào)道,雙組分系統(tǒng)DraR/DraK參與了天藍(lán)色鏈霉菌中抗生素生物合成的調(diào)控(Yeo et al.,2013)。在白色鏈霉菌M-Z18(Streptomyces albulus M-Z18)中,研究了高ε-聚-L-賴(lài)氨酸生產(chǎn)對(duì)酸性pH的生理響應(yīng),與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、脅迫響應(yīng)蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、細(xì)胞壁和細(xì)胞膜、次級(jí)代謝產(chǎn)物生產(chǎn)、DNA和RNA代謝以及核糖體亞基相關(guān)的基因在酸性pH響應(yīng)中起主要作用(Ren et al.,2015)。然而,關(guān)于pH沖擊對(duì)Val-A產(chǎn)量和生物合成途徑中基因表達(dá)影響的信息很少,而這些信息對(duì)于改進(jìn)抗生素發(fā)酵和降低成本具有重要價(jià)值。直到最近,我們首次采用堿性pH沖擊來(lái)增強(qiáng)Val-A的產(chǎn)量,并且初步確定pH沖擊的適宜pH約為8.0(Zhou et al.,2016)。
本研究旨在探討pH沖擊對(duì)Val-A發(fā)酵過(guò)程的影響,并揭示pH與Val-A產(chǎn)量之間的關(guān)系。基于吸水鏈霉菌5008在不同pH沖擊條件下合成Val-A的產(chǎn)量變化規(guī)律以及最新的基因組研究進(jìn)展,研究了pH對(duì)基因表達(dá)的影響及其在生理水平上的規(guī)律,以探索pH沖擊提高Val-A產(chǎn)量的機(jī)制。首先,選擇pH作為環(huán)境脅迫,從代謝活性分析角度提高Val-A產(chǎn)量,并構(gòu)建了結(jié)合pH沖擊的高效發(fā)酵策略。此外,依次探討了pH沖擊對(duì)基因表達(dá)和細(xì)胞微環(huán)境的影響。最后,全面討論了pH沖擊對(duì)Val-A生產(chǎn)的機(jī)制。據(jù)我們所知,這是在Val-A發(fā)酵中采用環(huán)境脅迫的首次嘗試。它也可為其他放線(xiàn)菌生產(chǎn)抗生素提供良好的參考。
2.材料與方法
2.1.微生物與發(fā)酵條件
所用菌株吸水鏈霉菌5008(Streptomyces hygroscopicus 5008)(CGMCC 4.1026)是工業(yè)上Val-A的生產(chǎn)菌株,保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。
孢子形成瓊脂培養(yǎng)基包含:豆粕20 g/L,麥芽糖20 g/L,瓊脂20 g/L。培養(yǎng)基用2mol/L NaOH調(diào)節(jié)至pH 7.0,并于121°C高壓滅菌20分鐘。在37°C培養(yǎng)八天后收集孢子,懸浮于20%(v/v)甘油中,并于-80°C保存?zhèn)溆谩?
種子培養(yǎng)基組成:玉米粉30 g/L,豆粕22 g/L,酵母提取物10 g/L,NaCl 2 g/L,KH2PO4 0.8 g/L。接種50μL孢子懸浮液(1.5 x 10?cfu/mL)后,在250mL搖瓶(含50 mL種子培養(yǎng)基)中,于37°C,220 rpm的旋轉(zhuǎn)搖床上進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。
對(duì)于Val-A生產(chǎn),發(fā)酵培養(yǎng)基包含:玉米粉100g/L,豆粕25g/L,酵母提取物5g/L,NaCl 1g/L,KH2PO4 1.5g/L。將5mL種子培養(yǎng)物接種到含有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中,在37°C和220 rpm下發(fā)酵5天(Zhou,et al.,2012;Zhou and Zhong,2015)。
2.2.提高Val-A產(chǎn)量的pH沖擊策略
2.2.1.不同堿液進(jìn)行pH沖擊
當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行24小時(shí)時(shí),分別向不同處理組的發(fā)酵液中加入2 mol/L NaOH、2 mol/L KOH和2 mol/L氨水,將發(fā)酵液的pH從自然pH 6.4調(diào)整到pH 8.0。
2.2.2.不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行pH沖擊
六個(gè)不同處理組的發(fā)酵分別進(jìn)行4 h、8h、12h、16h、20h和24h,然后向發(fā)酵液中加入2 mol/L NaOH將pH調(diào)整至pH 8.0,繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。
2.2.3.不同處理次數(shù)
三組設(shè)置如下:
一次pH沖擊處理:當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行20 h時(shí),向發(fā)酵液中加入2 mol/L NaOH將pH調(diào)整至pH 8.0。
兩次pH沖擊處理:當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行20 h和44 h時(shí),向發(fā)酵液中加入2 mol/L NaOH將pH調(diào)整至pH 8.0。
三次pH沖擊處理:當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行20 h、44 h和68h時(shí),向發(fā)酵液中加入2 mol/L NaOH將pH調(diào)整至pH 8.0。
2.3.細(xì)胞重量、殘余碳源和Val-A產(chǎn)量的分析
每天取2mL發(fā)酵液樣品用于分析細(xì)胞重量、殘余碳源和Val-A產(chǎn)量。樣品在12,000g下離心5分鐘。取0.5mL上清液用等體積氯仿萃取,然后用0.22-μm親水性濾膜過(guò)濾。含有Val-A的過(guò)濾樣品采用高效液相色譜法(HPLC)分析(Iwasa et al.,1971)。由于種子培養(yǎng)基中的玉米粉和豆粕不溶,標(biāo)準(zhǔn)的干重法不可行,因此使用標(biāo)準(zhǔn)的Bradford法測(cè)量細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)以反映細(xì)胞生長(zhǎng)(Kieser et al.,2000)。培養(yǎng)基中的總殘?zhí)亲鳛樘荚赐ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn)的苯酚-硫酸法測(cè)定(Liao et al.,2009)。