表5：飼喂以大麥青貯料為基礎日糧的小母牛的表觀全腸道養分消化率

表6：飼喂以大麥青貯料為基礎日糧，增加添加強化生物炭的小母牛的氮平衡

表7：飼喂以大麥青貯料為基礎日糧的小母牛的能量平衡

表8：飼喂以大麥青貯料為基礎的日糧的小母牛的甲烷排放量，日糧中含有增加添加的強化生物炭

添加EB對養分消化率和氮平衡沒有影響（P>0.17）（表5、6）。EB不會改變PD總產量、MP吸收量和MN流量（P=0.22）（表6）。能量平衡、產熱量和甲烷產量（克/天、克/千克DMI和克/千克DMD）也未受EB的影響（P>0.20）（表7、8）

表9：飼喂含2.0%強化生物炭大麥青貯日糧的小母牛的液體(LAM)、固體(SAM)和糞便(FAM)相關微生物的α多樣性指數

圖1：弦圖顯示了與處理(對照和2.0%強化生物炭)和來源(SAM，固體相關微生物；LAM，液體相關微生物；FAM，糞便相關微生物)相關的門的相對豐度(%)。該刻度表示總的累積豐度。每根弦的寬度代表了與每種處理和來源相關的每一門的相對豐度。帶*的類群表示有顯著差異的類群。

圖2:弦圖顯示了與處理(對照和2.0%強化生物炭)和來源(SAM，固體相關微生物；LAM，液體相關微生物)相關的屬的相對豐度(%)。該刻度表示總的累積豐度。每根弦的寬度代表與每種治療方法和來源相關的每個屬的相對豐度。帶*的家庭表示有顯著差異的家庭。

觀察到的OTU、均勻度和多樣性在EB處理之間沒有差異（P≥0.58），但在樣本來源方面均有差異（P<0.01）（表9）。EB處理與樣本來源之間存在交互作用（P<0.05），影響Spirochaetaes,Verrucomicrobia,Tenericutes and Elusimicrobia的相對豐度。EB使LAM和SAM中的Spirochaetaes數量增加（圖1）。只有微囊藻的相對豐度在LAM中與EB一起增加。在LAM中，EB降低了Tenericutes的相對豐度，增加了Elusimicrobia的相對豐度。在LAM和SAM中，EB會降低Fibrobacteres的相對豐度（P=0.05）。EB與樣本來源之間存在交互作用（P<0.05），影響了Prevotellaceae,Bacteroidales RF16 group,Bacteroidales BS11,Spirochaetaceae,和未培養的Verrucomicrobia的相對豐度（圖2）。在EB的作用下，LAM部分中Prevotellaceae,Bacteroidales RF16 group,Bacteroidales BS11組和未培養的Verrucomicrobia的相對豐度都有所增加。EB在LAM和SAM中分別增加了63%和30.3%。強化生物炭降低了LAM和SAM部分中Acidaminococcaceae and Bifidobacteriaceae的相對豐度（P<0.05）。在FAM組分中，EB在門或科的水平上沒有影響，但EB有增加Euryarchaeota相對豐度的趨勢（P=0.06）。

討論：

生物炭已被提議作為一種飼料添加劑，具有增強瘤胃發酵和減少腸道甲烷（CH4）產生的潛力。這項綜合研究考察了EB對肉牛新陳代謝和微生物種群的影響。據我們所知，這是第一項分別使用16SrRNA測序和開環呼吸室檢測EB對瘤胃和糞便微生物群及CH4排放影響的研究。

評估生物炭對瘤胃新陳代謝影響的一個難點是生物質來源的不同、熱解持續時間和溫度的變化以及可改變EB成分、孔隙率和化學性質的后處理改良所帶來的可變性。雖然之前的研究發現稻殼生物炭能產生積極的反應，但本研究使用的是松樹生物質炭，這是因為松樹生物質炭在整個北半球都有大量供應。然而，Saleem等人和Winders等人使用的生物質都是松樹，而且生物炭在表面積、體積密度和pH值方面仍然存在差異。這些因素可能會影響瘤胃內EB的活性以及微生物群和宿主動物隨后的新陳代謝反應。

與對照組相比，強化生物炭對總揮發性脂肪酸濃度或其各自比例沒有影響。這與Calvelo Pereira等人的研究結果一致，他們報告說，雖然生物炭的原始生物質（玉米秸稈與松樹）和加入量（81克/千克DM與186克/千克DM）會改變體外的VFA比例，但這些比例與對照處理相比并無差異。McFarlane等人也發現，不同來源的生物炭（即黃楊、白松和栗橡）不會改變體外VFA的產生，但該實驗缺乏對照。Saleem等人使用瘤胃模擬技術發現，隨著大麥青貯飼料中EB含量的增加（最多占日糧DM的2.0%），總VFA以及乙酸鹽、丙酸鹽、丁酸鹽和支鏈VFA的產生呈線性增加。在本研究中，只有支鏈VFA異丁酸（纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸脫氨的副產物）在2.0%EB的作用下減少。在異脂肪酸濃度和MP合成方面觀察到的變化與氨基酸脫氨和微生物氮流之間的關系一致。

0.5%EB中NH3-N濃度的降低與Garillo等人的研究結果一致，他們也指出，在喂養成熟山羊的高粗飼料中添加0.6%活性炭時，NH3-N濃度會降低。雖然Garillo等人報告了NH3-N產量的變化，但不同處理間的原生動物數量并無差異。相反，Saleem等人報告說，隨著生物炭濃度的增加，NH3-N呈線性增加趨勢（P=0.06），但這并沒有改變原生動物的數量。本研究中觀察到的原生動物減少現象被認為是EB非選擇性吸附特性的結果，但這種相互作用導致原生動物減少的確切細胞機制尚待闡明。盡管NH3-N和異丁酸濃度的下降可能與EB介導的原生動物減少有關，但這種反應并未改變MP合成或OM消化率。

原生動物會捕食利用NH3-N作為蛋白質來源的細菌，因此原生動物數量的減少可能會通過豐富細菌蛋白質合成來改善瘤胃氮代謝。然而，本研究并未觀察到明顯的營養消化率提高。這一發現與Winders等人的研究結果一致，他們在飼喂含有3%DM生物炭的高飼草或高精飼料的犢牛時，沒有觀察到犢牛消化道總消化率的變化。與缺乏影響相反，Van等人發現，飼喂0.5克和1克/千克體重竹炭的生長山羊的DM、OM和CP消化率得到提高，氮的保留率增加。Van等人使用的山羊飼喂含有單寧酸的芒果相思樹，這可能是造成不同研究之間差異的原因之一。喂養的山羊含有單寧酸。生物炭可以吸收有毒化合物，防止它們被胃腸道吸收。

2.0%EB的最低pH值升高，pH值變化減小，這可能是由于本研究中使用的EB具有堿性（pH值為7-8）。Van等人報告說，飼喂活性炭的山羊瘤胃pH值往往較高。此外，CalveloPereira等人報告說，用186克/千克DM的生物炭腌制的草在128天后pH值升高。CalveloPereira等人使用的生物炭的pH值介于9.16到9.89之間，由松樹屑或玉米秸稈在350或550℃下熱解產生。本研究中使用的EB由于采用了中和工藝，pH值為7-8，因此對瘤胃pH值的增加作用微乎其微。相比之下，Saleem等人使用了pH值為4.8的生物炭，但這并沒有影響RUSITEC瘤胃內的pH值。

盡管在本研究中，EB并未影響腸道的CH4排放，但Leng等人報告說，稻殼生物炭使幼年肉牛的CH4產量減少了24.3%，活重增加了20.2%。同樣，Saleem等人也報告說，在RUSITEC中，CH4的產生量減少了25.2%。關于生物炭如何促進瘤胃中CH4排放量的減少，人們提出了許多假設。其中包括生物炭的高表面積、多孔結構、高離子交換和吸收特性可促進生物膜的形成。然而，已知甲烷菌是瘤胃中生物膜不可或缺的成員，從理論上講，生物膜發展的增加實際上會導致瘤胃中CH4產量的增加。此外，根據電子顯微鏡觀察，在生物炭上形成的表面生物膜似乎比在谷物等容易消化的飼料表面形成的生物膜要不發達得多。

也有人提出，生物炭可以增加產甲烷菌的豐度，抑制產甲烷菌，或吸收瘤胃內產生的CH4。不過，這一點還有待評估。甲烷營養體能夠在與硫酸鹽、硝酸鹽或金屬氧化物的還原反應中厭氧氧化CH4。瘤胃中是否存在甲烷營養體以及甲烷營養體的相對重要性仍存在爭議，因為研究發現瘤胃中不存在甲烷營養體或甲烷營養體含量極低。除了與甲烷氧化相關的代謝途徑外，甲烷營養體也有可能從其他代謝途徑獲取能量。此外，日糧中低濃度（0.3-3.0%DM）的生物炭吸收瘤胃中產生的大量CH4的可能性似乎不大。同時，在SAM和LAM中，EB在門、科或屬一級對產生CH4的微生物--古細菌沒有影響，這表明在給藥濃度下，EB對甲烷菌也沒有直接毒性。Winders等人的研究與我們的研究結果一致，他們發現以0.8%或3.0%的DM量飼喂全松樹生物炭并不會降低生長期或育成期飼料中母牛的甲烷產生量。

雖然EB沒有改變α-多樣性指數，但它確實引起了幾個門和科的變化。纖維細菌被認為是瘤胃中主要的木質纖維素降解菌，EB使其在LAM和SAM中的豐度下降。螺旋體，另一個假設扮演EB在LAM和SAM中均增加了復合纖維降解的作用。有趣的是，對EB處理有反應的所有其他門類都與液體有關，這可能是EB微粒在瘤胃內容物液體部分中分散的反映。瘤胃微生物群中的瘤胃微生菌（Verrucomicrobia）、瘤胃單胞菌（Tenericutes）和瘤胃擬桿菌（Elusimicrobia）通常是次要成員，它們在瘤胃中的作用尚不清楚。擬桿菌科（Prevotellaceae）是瘤胃微生物群中的優勢科，EB會增加它們的數量。同樣，EB也增加了瘤胃中另外兩個類桿菌科（類桿菌RF16組和類桿菌BS11腸道組）的數量。EB減少了屬于固有菌門的酸性氨基球菌科（Acidaminococcaceae），該科的代表是琥珀酸菌屬（Succiniclasticum），已知該菌可將琥珀酸發酵成丙酸。EB使屬于放線菌門的雙歧桿菌科在LAM和SAM中的數量減少了64.0%。在纖維較多的膳食中，雙歧桿菌科微生物的數量有所增加，可能參與了植物衍生復合碳水化合物的代謝。盡管這些微生物種群發生了變化，但似乎與瘤胃發酵或新陳代謝中可量化的變化無關。

在土壤中，添加30兆克/公頃-1的生物炭不會改變生物群（細菌、真菌、原生動物、線蟲和節肢動物）。此外，通過緩慢熱解產生的生物炭（0.5%土壤DM；15噸/公頃）也沒有改變微生物數量或群落結構，但在培養720小時后，真菌的數量有所增加。這可能是由于真菌具有降解難降解飼料的能力。另外，一項薈萃分析研究發現，短期和長期施用生物炭后，改良土壤的微生物豐度和多樣性都有所提高。與土壤相比，生物炭在瘤胃中的停留時間較短，因此微生物的結果預計會有所不同。

要估計EB在瘤胃微生物群中的作用程度，還需要進一步的研究。總體而言，與液體相關的微生物受EB的影響大于與瘤胃微生物相關的微生物，這表明瘤胃微生物會被動地困在EB的多孔結構中。另外，SAM已經與飼料顆粒緊密結合，不會直接暴露在EB中。盡管日糧中添加EB后糞便的顏色發生了顯著變化，但糞便中的細菌數量沒有變化。有趣的是，盡管有報道稱經生物炭處理過的糞便在堆肥過程中會減少CH4的排放，但FAM中的Euryarchaeota有增加的趨勢，而Euryarchaeota是與產生CH4的古細菌相關的一個門類。

總之，EB不會改變瘤胃發酵、CH4產量或表觀總消化率。