3結(jié)果與討論

3.1 Geobacter生物膜生長(zhǎng)

圖1顯示了在恒定電位下（與Ag/AgCl相比為0.1 V）基于碳布的Geobacter生物膜隨時(shí)間的電流產(chǎn)生變化。紅色箭頭表示測(cè)量生物膜生長(zhǎng)期間進(jìn)行pH和CV測(cè)量的電流。從這張圖中可以看出，電流密度在45小時(shí)接種后達(dá)到了1.07A m-2，如第一個(gè)紅色箭頭所示。隨著細(xì)菌或生物膜的附著增加，電流密度呈上升趨勢(shì)，直至256小時(shí)接種后達(dá)到5.89A m-2。此后，隨著時(shí)間的推移，Geobacter生物膜的電力產(chǎn)生能力進(jìn)一步提高。值得指出的是，在440小時(shí)生長(zhǎng)后，最大電流密度驚人增長(zhǎng)至10.71 A m-2。之后呈穩(wěn)定下降趨勢(shì)。然后在462小時(shí)時(shí)更換了新的陽(yáng)極液并再次循環(huán)?？梢钥吹?，電流重新開(kāi)始并在10.70A m-2達(dá)到最大值，幾乎與之前的最大電流密度相等，這意味著長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)行時(shí)，深層生物膜生長(zhǎng)受到底物短缺或質(zhì)子積累（低pH）的限制，這些對(duì)生物膜活性具有抑制作用。在576小時(shí)運(yùn)行后，提取了呼吸陽(yáng)極生物膜進(jìn)行生物多樣性分析。16S rRNA分析結(jié)果顯示，Geobacter spp占74%，如圖S3(a)所示。還進(jìn)行了重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果清楚地顯示，與此處的生物陽(yáng)極得到了類似的電流密度，如圖S1(c)所示。生物多樣性分析表明，Geobacter spp在圖S3(b)中占65%。

圖1.在恒定施加電位（-0.1 V vs.Ag/AgCl）下的Geobacter生物膜生長(zhǎng)情況。紅色箭頭表示用于pH和CV測(cè)量的各種電流密度（它們分別為1.07A m 2，1.27A m 2，2.58 A m 2，2.97A m 2，4.46 A m 2，5.89 A m 2，7.93 A m 2，9.25 A m 2，9.83 A m 2，10.71A m 2，10.23 A m 2和10.70A m 2，分別為45小時(shí)，72小時(shí)，116小時(shí)，140小時(shí)，205小時(shí)，256小時(shí)，285小時(shí)，330小時(shí)，418小時(shí)，440小時(shí)，455小時(shí)和482小時(shí)）。

3.2 Geobacter生物膜內(nèi)原位pH分布

為了量化Geobacter生物膜深度方向上的實(shí)時(shí)pH分布，使用pH微電極獲得了pH-深度剖面。它們?cè)诓煌碾娏魉较逻M(jìn)行了測(cè)量，如圖1中所示的紅色箭頭。pH微電極尖端首先放入批量溶液中，距離生物膜表面數(shù)千微米，然后逐步向下移動(dòng)。考慮到生物膜表面的不規(guī)則性，每個(gè)電流密度選取了至少3個(gè)位置進(jìn)行pH測(cè)量，測(cè)得的數(shù)據(jù)見(jiàn)圖S4。每個(gè)電流密度的平均pH-深度剖面計(jì)算并繪制如圖2(a)–(e)所示。發(fā)現(xiàn)在每個(gè)pH-深度剖面中都存在一個(gè)靠近0mm處的小區(qū)域（圖2中），在該區(qū)域中，測(cè)得的pH值變化很小或幾乎保持不變。這表明微電極尖端已經(jīng)進(jìn)入到電極表面的附近。因此，可以假設(shè)這個(gè)小區(qū)域位于生物膜底部附近，即電極表面。在圖2中，生物膜底部（電極表面）位于深度為0mm處。預(yù)期，隨著微電極尖端從溶液（3500mm）向陽(yáng)極表面（0mm）移動(dòng)，pH逐漸降低，無(wú)論生物膜的年齡如何，都會(huì)發(fā)生這種情況。圖2(f)展示了在7.93 A m-2下測(cè)得的一個(gè)pH-深度剖面及其相應(yīng)的質(zhì)子濃度深度（PCdepth）剖面?？梢郧宄乜吹?，pH曲線呈S形，PC曲線呈鋸齒狀。實(shí)際上，在所有實(shí)驗(yàn)中，“S”和“Z”形狀的曲線始終存在。仔細(xì)觀察圖2(a)–(e)，可以看到沿深度方向的pH分布可以分為三個(gè)典型區(qū)域，即陽(yáng)極生物膜、濃度邊界層和批量溶液。由于它們具有不同的主要功能，這三個(gè)區(qū)域顯示出不同的特性。眾所周知，由于在批量溶液中沒(méi)有微生物營(yíng)養(yǎng)物去除和緩沖溶液的影響，在該區(qū)域中pH預(yù)計(jì)應(yīng)保持在一個(gè)常數(shù)附近，這與生物系統(tǒng)中底物和/或氧分布的趨勢(shì)相似。在圖2中，一個(gè)陡峭的斜坡總是出現(xiàn)在750和1300mm之間的所有剖面中，實(shí)際上是位于邊界層和批量溶液之間的界面，這種急劇下降也表明pH微電極尖端從批量溶液中穿過(guò)界面層，然后穿過(guò)界面層以及之后的電力生產(chǎn)生物膜。

圖2.在電流密度為1.07A m-2和1.27A m 2時(shí)Geobacter生物膜內(nèi)的平均pH分布，邊界層和批量溶液（a）；在2.58 A m 2和2.97 A m 2時(shí)（b）；在4.46 A m 2，5.89 A m 2和7.93A m 2時(shí)（c）；在9.25 A m 2和9.83 A m 2時(shí)（d）；在10.71A m 2，10.23 A m 2和10.70A m 2時(shí)。誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖2(f)是在7.93A m 2下測(cè)量的剖面之一，以及Geobacter生物膜內(nèi)上方和內(nèi)部的質(zhì)子濃度剖面。

3.3 Geobacter生物膜的厚度

在生物電化學(xué)系統(tǒng)中，證明了質(zhì)子主要通過(guò)對(duì)緩沖系統(tǒng)的共軛堿（即，HPO2 4tHt!H2P4）質(zhì)子化而從陽(yáng)極生物膜中轉(zhuǎn)運(yùn)出來(lái)。使用pH微電極獲得的pH數(shù)據(jù)實(shí)際上只反映了未絡(luò)合的質(zhì)子（自由質(zhì)子）的濃度。Marcus等人開(kāi)發(fā)了一個(gè)描述陽(yáng)極生物膜建模的平臺(tái)，描述了電中性、ARB半反應(yīng)、擴(kuò)散、遷移和酸堿化學(xué)的同時(shí)發(fā)生的現(xiàn)象。他們的結(jié)果顯示，pH發(fā)展與邊界層內(nèi)的深度之間具有近似線性關(guān)系，并且在生物膜內(nèi)具有指數(shù)關(guān)系，這與我們?cè)趫D2中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果非常一致。我們知道，當(dāng)pH微電極開(kāi)始從濃度邊界層穿過(guò)生物膜時(shí)，pH值應(yīng)該有最大的下降。因此，通過(guò)計(jì)算pH到深度的一階導(dǎo)數(shù)，可以根據(jù)斜率趨勢(shì)識(shí)別生物膜或界面的位置。通過(guò)這種方式，可以估算生物膜的厚度和邊界層的厚度。

以7.93 Am-2的pH-深度剖面為例，選擇了5個(gè)位置進(jìn)行pH測(cè)量。它們的一階導(dǎo)數(shù)圖在圖3(a)中呈現(xiàn)。將這些圖的平均值作為插圖顯示的平均一階曲線?？梢郧宄乜吹剑谂咳芤?、邊界層和Geobacter生物膜中，斜率完全不同。在批量溶液中，導(dǎo)數(shù)保持在零附近，因?yàn)榇颂幍膒H值大致是常數(shù)，然后導(dǎo)數(shù)遠(yuǎn)離零，反映出微電極逐步向下移動(dòng)進(jìn)入邊界層。在那之后，它逐漸增加到pH/mm的斜率，直到獲得最大斜率。可以發(fā)現(xiàn)，在邊界層中，導(dǎo)數(shù)并不保持不變，這可能是由邊界層中的游離細(xì)菌引起的。實(shí)際上，最大斜率的位置是陽(yáng)極生物膜和邊界層的界面。這是因?yàn)殡娏骰蛸|(zhì)子H+實(shí)際上是在生物膜內(nèi)產(chǎn)生的，并且底物在這個(gè)界面上接觸到?？梢灶A(yù)期，由于H+和底物的擴(kuò)散效應(yīng)，離開(kāi)界面的位置的H+梯度和因此pH值的梯度趨向于減小。在Geobacter生物膜內(nèi)部，斜率急劇下降，直到達(dá)到生物膜底部，因?yàn)閮?nèi)部的有效擴(kuò)散系數(shù)減小。正如可以清楚地看到的那樣，插圖中的最大斜率的拐點(diǎn)位于約275mm的深度處，因此是生物膜厚度dbiofilm。代謝不活躍的生物膜層也可以通過(guò)在該區(qū)域檢測(cè)到的pH值與活躍生物膜相比呈相反趨勢(shì)來(lái)檢測(cè)到。如圖2(d)和圖2(e)所示，在陽(yáng)極表面附近，pH值要么保持在一個(gè)較低值的常數(shù)，要么隨深度減小而減小。這表明，這里的質(zhì)子主要是從外部活躍細(xì)胞傳輸?shù)?。這也解釋了為什么這個(gè)區(qū)域的導(dǎo)數(shù)等于或小于零。

應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是，我們實(shí)際上開(kāi)發(fā)了一種方法來(lái)使用測(cè)得的pH-深度剖面估算生物膜的厚度，該方法從陽(yáng)極表面延伸到批量溶液。為了更清楚地描述，該方法總結(jié)如下：

（1）借助pH微電極，在給定的生物膜生長(zhǎng)階段垂直于深度方向的不同位置獲取沿深度方向的pH分布；

（2）使用在給定生物膜生長(zhǎng)階段獲得的pH分布，計(jì)算pH對(duì)深度的一階導(dǎo)數(shù)；

（3）從（2）中獲得的一階導(dǎo)數(shù)中計(jì)算平均一階導(dǎo)數(shù)；

（4）將平均一階導(dǎo)數(shù)根據(jù)深度繪制出來(lái)；

（5）定義平均一階導(dǎo)數(shù)獲得其最大值的深度為生物膜厚度或生物膜和邊界層的界面。

（6）界面的右側(cè)屬于邊界層和批量溶液之間。這個(gè)厚度是任意的。在這里，我們將該厚度定義為從其最大值減小到其最大值的1%所需的距離。

（7）生物膜可以進(jìn)一步分為活躍部分和不活躍部分。不活躍部分的生物膜是靠近陽(yáng)極的區(qū)域，其pH值非常小或呈負(fù)值。不活躍部分的厚度可以通過(guò)讀取相應(yīng)的pH-深度分布來(lái)確定?；钴S部分的厚度等于生物膜厚度減去不活躍部分的厚度。

使用上述方法，獲得了其他電流密度下的一階導(dǎo)數(shù)圖見(jiàn)圖S5(a)-(h)。插圖是每個(gè)電流密度的平均一階曲線。圖3(b)總結(jié)了包括不活躍部分和活躍部分的Geobacter生物膜厚度。從這張圖中可以看出，生物膜厚度不斷增加。在1.27 A m-2時(shí)約為90um，如果電流增加到2.97 A m-2，則為190um。在285小時(shí)的首次接種中它大幅增加，這意味著隨著時(shí)間的推移，附著的細(xì)菌/生物膜增加了。在7.93 A m-2時(shí)達(dá)到了275um的厚度。之后，活躍生物膜的發(fā)展減緩，然后在9.25 A m-2時(shí)達(dá)到300um，周圍有部分不活躍的生物膜層約為25um。我們發(fā)現(xiàn)，活躍生物膜層的厚度后來(lái)保持在約275um左右?guī)缀醪蛔?，這表明由于陽(yáng)極生物膜附近的底物或低pH的可用性，其厚度已經(jīng)達(dá)到了最大值。因此，我們可以說(shuō)，從陽(yáng)極生物膜表面到頂部的275um，其產(chǎn)生質(zhì)子并消耗乙酸的區(qū)域是新陳代謝活躍的。檢測(cè)到的不活躍生物膜厚度在10.71 A m-2時(shí)增加到約50mm，在10.23A m-2時(shí)增加到約75mm。這個(gè)結(jié)果證明了靠近電極的細(xì)胞形成了密集的不活躍層，并且可能會(huì)限制乙酸或/和pH，因?yàn)橐呀?jīng)證明與370um Geobacter生物膜內(nèi)的外部生物膜相比，電極附近的有效擴(kuò)散系數(shù)大大減小。但是，即使存在不活躍區(qū)域，生物膜的細(xì)胞外電子傳遞也不會(huì)受到阻礙，即使生物膜厚度達(dá)到數(shù)百微米，因?yàn)殡妼?dǎo)率足夠大，可以使細(xì)胞在這個(gè)區(qū)域之間傳輸電子。這解釋了為什么電流密度不會(huì)下降，即使存在不活躍區(qū)域。在本研究中，邊界層厚度在450-650um范圍內(nèi)變化。

圖3.在7.93A m-2下pH對(duì)深度的一階導(dǎo)數(shù)圖，插圖顯示了平均曲線，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。（a）；各種電流密度下的生物膜厚度及其活性部分和非活性部分（b）。