摘要：本研究通過(guò)使用pH微電極，量化了電力生產(chǎn)生物膜及其濃度邊界層內(nèi)的空間pH分布，以及批量溶液中的pH分布。探討了pH分布與電流密度之間的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)：（1）與批量溶液的pH 6.90相比，Geobacter生物膜內(nèi)的陽(yáng)極表面附近的pH水平低至5.57；（2）生物膜內(nèi)的平均pH水平隨時(shí)間減小；（3）生物膜內(nèi)的pH變化改變了循環(huán)伏安法的中點(diǎn)電位，每單位pH下降59.0 mV；（4）對(duì)于25 mM磷酸鹽緩沖溶液，陽(yáng)極表面附近的pH水平低至4.91，而對(duì)于100 mM磷酸鹽緩沖溶液，則為5.73。此外，還提出了一種通過(guò)繪制pH-深度剖面的導(dǎo)數(shù)來(lái)估算生物膜厚度的方法。

1引言

電力生產(chǎn)生物膜以一種獨(dú)特的方式進(jìn)行呼吸，利用固體外部材料作為其新陳代謝的終端電子受體，這在生物電化學(xué)系統(tǒng)（BESs）中作為催化劑具有興趣，例如微生物燃料電池（MFCs）和微生物電解電池（MECs），以及海水淡化、生物修復(fù)和傳感系統(tǒng)[1-4]。陽(yáng)極呼吸細(xì)菌（ARB）利用MFCs、MECs或其他生物電化學(xué)系統(tǒng)的陽(yáng)極進(jìn)行呼吸，最終將電子從微生物轉(zhuǎn)移到陽(yáng)極。陽(yáng)極生物膜的電流是由氧化反應(yīng)引起的，其中發(fā)生氧化反應(yīng)，底物如乙酸或其他有機(jī)物質(zhì)被消耗。在這個(gè)過(guò)程中，質(zhì)子釋放到陽(yáng)極液中，電子轉(zhuǎn)移到陽(yáng)極[5,6]，如式（1）所示。

（1）

電子轉(zhuǎn)移必須伴隨質(zhì)子轉(zhuǎn)移以保持溶液電中性，這預(yù)計(jì)會(huì)導(dǎo)致生物電流外部和內(nèi)部產(chǎn)生pH梯度。此外，更高的電流產(chǎn)生可能會(huì)導(dǎo)致更大的質(zhì)子積累，而這反而可能對(duì)陽(yáng)極生物膜的生長(zhǎng)和電子產(chǎn)生產(chǎn)生抑制作用[7-9]。眾所周知，pH在確定電力生產(chǎn)生物膜性能方面起著關(guān)鍵作用，因此，了解生物膜內(nèi)的pH分布對(duì)于理解BESs中的電子產(chǎn)生和傳輸機(jī)制非常重要。

大多數(shù)關(guān)于pH變化對(duì)陽(yáng)極生物膜影響的研究局限于批量溶液。研究表明，隨著緩沖液濃度的增加，電流密度增加，表明電流密度受生物膜外質(zhì)子傳輸?shù)南拗芠5]。Franks等人證明，當(dāng)將批量pH從6.9改變?yōu)?.15時(shí)，使用Geobacter sulfurreducens作為陽(yáng)極生物膜時(shí)，電流減少了50%[10]。為了更好地理解質(zhì)子傳輸機(jī)制，還建立了數(shù)學(xué)模型來(lái)預(yù)測(cè)電化學(xué)活性生物膜（EABs）中的質(zhì)子傳輸。預(yù)測(cè)了100mm厚陽(yáng)極生物膜中的pH變化為0.03單位[11]。Marcus等人預(yù)測(cè)，對(duì)于15 A m2，450mm陽(yáng)極生物膜上的pH變化為1.5單位[7,8]。通過(guò)引入pH敏感熒光探針測(cè)量了Geobacter生物膜內(nèi)4個(gè)不同深度的pH值。發(fā)現(xiàn)陽(yáng)極表面附近的pH水平為6.1，而外部介質(zhì)中為7[10]。Babauta等人使用微電極測(cè)量了在1.05 mA電流下Geobacter生物膜內(nèi)的pH從6.8下降到6.5，在1.85 mA電流下從6.9下降到6.3[12]。這些研究證明了電力生產(chǎn)生物膜內(nèi)pH分布的重要性。因此，目前仍不清楚電流密度和陽(yáng)極生物膜內(nèi)pH分布如何相互關(guān)聯(lián)。細(xì)胞產(chǎn)生的質(zhì)子及其從陽(yáng)極生物膜中傳輸出來(lái)，應(yīng)導(dǎo)致生物膜內(nèi)形成質(zhì)子梯度?？缭缴锬ど疃鹊膒H梯度的形成會(huì)導(dǎo)致內(nèi)部微生物的性能降低，并影響其生長(zhǎng)[13]。因此，理解微尺度生物膜內(nèi)pH分布的詳細(xì)特性及其對(duì)電力生產(chǎn)性能的影響對(duì)于改善更好性能的陽(yáng)極至關(guān)重要。

本研究的目標(biāo)是量化電力生產(chǎn)生物膜深度的空間和時(shí)間pH分布和變化。還探討了pH分布與電流密度之間的關(guān)系。Geobacter spp是電力生產(chǎn)細(xì)菌的優(yōu)秀候選者，因?yàn)樗梢詫⒁宜徂D(zhuǎn)化為電子，并且電子轉(zhuǎn)移被認(rèn)為是直接的[3,11,12,14]。通過(guò)pH微電極獲取了Geobacter生物膜內(nèi)的pH-深度剖面，這種方法允許在活體生物膜中進(jìn)行非侵入性、無(wú)破壞性、高空間分辨率和實(shí)時(shí)測(cè)量。找到上述條件取決于了解陽(yáng)極生物膜內(nèi)微觀尺度條件，這在目前作者所知之前尚未報(bào)告過(guò)。此外，還建議通過(guò)繪制pH-深度剖面的導(dǎo)數(shù)來(lái)估算生物膜和邊界層的厚度。

2材料和方法

2.1生物反應(yīng)器

電力生產(chǎn)生物膜在一個(gè)三電極生物反應(yīng)器（300 mL）中生長(zhǎng)在工作電極上，在恒定的施加電位下（相對(duì)于Ag/AgCl為0.1 V）。碳布（0.36 0.02 mm厚）的投影表面積為2.4cm2（2.0 cm 1.2 cm），過(guò)大的Pt網(wǎng)格（2.0 cm 2.0 cm）作為工作和對(duì)電極，參考電極為Ag/AgCl（3 M KCl，Leici Instruments，上海，中國(guó)）。碳布購(gòu)自上海賀森電器有限公司，Pt網(wǎng)格購(gòu)自天津愛(ài)達(dá)恒升科技有限公司。該反應(yīng)器的接種物來(lái)自一臺(tái)連續(xù)運(yùn)行了6個(gè)月以上，具有Geobacter富集細(xì)菌群落（65%）的乙酸喂養(yǎng)MFC，最初來(lái)自北京高碑店污水處理廠。在初次接種時(shí)，生長(zhǎng)介質(zhì)流動(dòng)停止了24小時(shí)，以鼓勵(lì)細(xì)菌附著到工作電極上。此后，含有乙酸的厭氧、氮?dú)獬錃獾呐囵B(yǎng)基通過(guò)具有5小時(shí)水力停留時(shí)間的反應(yīng)器循環(huán)。乙酸被用作電子供體，工作電極被用作電子受體。所有實(shí)驗(yàn)均在35 0.5°C的恒溫箱中進(jìn)行。生長(zhǎng)培養(yǎng)基包含CH3COONa（1.64 g L1），NaCl（0.1 g L1），NH4Cl（0.5 g L1），MgSO4 7H2O（0.1 g L1），CaCl2 2H2O（0.02 g L1），每升10 mL Wolfe維生素溶液[12]和50 mM磷酸鹽緩沖液。每次進(jìn)行pH和CV測(cè)量后，將反應(yīng)器中的培養(yǎng)基倒出，以去除生物反應(yīng)器內(nèi)壁上的懸浮細(xì)菌堆積物。然后再次循環(huán)新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。此外，還進(jìn)行了一組重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 pH微電極的校準(zhǔn)

使用pH微電極（Unisense，丹麥）對(duì)陽(yáng)極生物膜內(nèi)的pH分布進(jìn)行表征。微電極尖端直徑為50微米。在每次測(cè)量之前，使用商業(yè)緩沖溶液（pH=4.01、6.86和9.18）對(duì)pH微電極進(jìn)行校準(zhǔn)。獲得了線(xiàn)性校準(zhǔn)曲線(xiàn)，斜率在-58.10至-58.80 mV/pH范圍內(nèi)。每次測(cè)量后也進(jìn)行了后校準(zhǔn)。

2.3 pH微電極測(cè)量

在操作條件下進(jìn)行了pH測(cè)量。通過(guò)移除生物膜陽(yáng)極上方的橡膠塞打開(kāi)孔口，插入微電極及其參比電極。純氮?dú)獬掷m(xù)從孔口進(jìn)入頂空，以最小化氧氣從開(kāi)口處進(jìn)入系統(tǒng)。將pH微電極尖端首先放入距離生物膜表面數(shù)千微米的溶液中，然后逐步向下移動(dòng)（步長(zhǎng)為50-200微米在生物膜外部和25微米在生物膜內(nèi)部），由計(jì)算機(jī)上的SensorTrace Profiling軟件進(jìn)行定期控制，并同時(shí)記錄pH值。當(dāng)通過(guò)批量溶液、濃度邊界層并最終到達(dá)生物膜底部（陽(yáng)極表面）時(shí)進(jìn)行記錄。