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結果:
1.膿毒癥小鼠肺組織中的ERS升高
圖2:膿毒癥小鼠肺部內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白的表達。在小鼠接受中電手術前、手術后2h、8h、12h和24h采集肺組織。用Western印跡法檢測總PERK(A)和eIF2α(A)、p-PERK(A和B)和p-eIF2α(A和C)以及IRE1α(A和D)。
ER應激信號與敗血癥密切相關。PERK/eIF2α和肌醇需要酶α(IRE1α)是ER應激的兩個主要標志物。為了觀察膿毒癥時ER壓力的變化,我們檢測了膿毒癥后不同時期PERK和eIF2α、p-PERK和p-eIF2α以及IRE1α的總表達量。膿毒癥誘導了CLP術后2h至24h肺內(nèi)PERK和eIF2α蛋白的磷酸化(圖2),而PERK和eIF2α的總蛋白水平無顯著差異(圖2)。此外,敗血癥刺激了ER相關蛋白IRE1α在2小時至24小時內(nèi)的表達(圖2)。p-PERK和p-eIF2α以及IRE1α的表達峰值出現(xiàn)在CLP后12h,12h與其他時間點相比有顯著差異(圖2)。這些結果表明,膿毒癥通過PERK和eIF2α蛋白的磷酸化誘導ER應激,IRE1α的增加具有時間依賴性。
2.TM和4-PBA對敗血癥小鼠肺組織中ERS相關蛋白的影響
圖3:4-苯基丁酸(PBA)和TM對敗血癥小鼠肺內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激途徑的影響。在CLP前給小鼠腹腔注射4-苯基丁酸(40毫克/千克),CLP12小時后收集肺部樣本。通過Western印跡檢測總PERK(A)和eIF2α(A)、p-PERK(A和B)和peIF2α(A和C)、CHOP(A和G)、ATF(A和F)、IRE1α(A和D)和XBP1(A和E)蛋白的表達。
為了進一步探討ERS在敗血癥中的影響,研究人員使用ERS的抑制劑和誘導劑4-PBA和曲卡霉素(TM)來治療CLP或假手術后的小鼠。結果顯示,CLP誘導了膿毒癥小鼠肺組織中PERK和eIF2α的磷酸化,并增加了CHOP、ATF4、IRE1α和XBP1的表達(圖3)。重要的是,與CLP組相比,給藥4-PBA能顯著減少ERS的發(fā)生,與CLP組相比,CLP術后PERK和eIF2α的磷酸化以及CHOP、ATF4、IRE1α和XBP1的表達均受到抑制(圖3)。相反,與CLP組相比,TM對ERS相關蛋白有增強作用(圖3)。這些結果表明,4-PBA和TM分別抑制和增強了敗血癥中ERS的激活。
3.ERS調(diào)節(jié)膿毒癥小鼠重要器官和組織的自噬活性
圖4:4-PBA和TM對膿毒癥小鼠自噬相關蛋白和重要器官的影響。CLP前腹腔注射4-PBA和TM,CLP12小時后收集肺、肝和腎樣本。通過Western印跡檢測敗血癥小鼠肺(A和D)、肝(B和E)和腎(C和F)組織中LC3、Beclin1、PINK1和Parkin的表達。給小鼠實施中電手術和注射4-PBA和TM后,用透射電子顯微鏡觀察自噬體(G)。黃色箭頭表示雙膜自噬體或自溶體。
之前的研究結果表明,敗血癥會刺激ERS和自噬的發(fā)生和發(fā)展。在此,為了研究ERS對膿毒癥小鼠肺、肝和腎組織中自噬途徑活性的影響,小鼠在CLP手術前接受了4-PBA和TM治療。從數(shù)據(jù)中,我們發(fā)現(xiàn)CLP引發(fā)了肺、肝和腎組織中自噬蛋白LC3II、Beclin1、PINK1和Parkin增加(圖4A、B、C、D、E和F)。TM,ERS誘導劑抑制LC3II、Beclin1、PINK1和Parkin與CLP組的比較(圖4),而ERS抑制劑4-PBA逆轉(zhuǎn)了TM對化膿癥中LC3II、Beclin1、PINK1和Parkin的表達增加小鼠(圖4A,B,C,D,E和F)。與這些結果一致,我們還利用TEM觀察了雙膜自噬體的形成和自噬體空泡的數(shù)量。中電誘導的敗血癥誘導了自噬活性并增加了自噬體的數(shù)量(圖G和H)。與CLP組相比,當4-PBA進一步增加自噬體數(shù)量時,TM抑制了CLP操作誘導的自噬體數(shù)量(圖4G和H)?;谶@些發(fā)現(xiàn),ERS增加了敗血癥誘導的自噬活性。
4.缺失ERS可減輕敗血癥小鼠肺、肝和腎的組織損傷和功能障礙
圖5:4-PBA和TM對敗血癥小鼠重要器官病理損傷的影響。給小鼠腹腔注射4-PBA和TM后,在CLP12小時后收集肺、肝和腎樣本。通過蘇木精和伊紅(H&E)染色檢測肺、肝和腎的病理變化(A,放大100倍)。計算損傷評分水平(B、C和D)。
圖6:4-PBA和TM對敗血癥小鼠重要器官功能的影響。給小鼠腹腔注射4-PBA和TM后再進行CLP。術后12小時檢測肺MPO活性(A)、BLA總蛋白(B)、肺W/D(C)、ALT(D)、AST(E)、Cr(F)和BUN(G)。分析小鼠的存活率(CLP手術前、手術后1d、2d、3d、5d和7d)(H)。
與我們之前的研究一致,膿毒癥誘導肺、肝、腎組織學損傷并導致器官功能障礙(圖5和圖6)。有趣的是,當對膿毒癥小鼠給予4-PBA時,與CLP組相比,敗血小鼠的組織病理學改變,如水腫、出血、組織炎癥細胞浸潤、肝細胞變性或氣球變性、肝細胞局灶性壞死、腎小球腫脹和腎小球炎癥細胞等,減弱,組織學損傷評分降低(圖5A,B、C和D)。此外,與CLP組相比,CLP+4-PBA組敗血癥引起的BLA總蛋白、MPO活性、肺W/D、血清AST和ALT(肝功能異常的標志物)、血清Cr和BUN(腎功能的常規(guī)指標)的增加在4-PBA治療后有所緩解(圖6A、B、C、D、E、F和G)。然而,TM治療逆轉(zhuǎn)了4-PBA對敗血癥組織病理學改變和器官功能障礙的保護作用(圖6A、B、C、D、E、F和G)。
隨后,我們檢測了ERS抑制劑是否能提高敗血癥小鼠的存活率。與CLP組相比,給予4PBA能顯著提高膿毒癥小鼠的存活率,而在CLP+TM組,TM會降低小鼠的存活率(圖5H)。