結果:

1.膿毒癥小鼠肺組織中的ERS升高

圖2：膿毒癥小鼠肺部內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白的表達。在小鼠接受中電手術前、手術后2h、8h、12h和24h采集肺組織。用Western印跡法檢測總PERK（A）和eIF2α（A）、p-PERK（A和B）和p-eIF2α（A和C）以及IRE1α（A和D）。

ER應激信號與敗血癥密切相關。PERK/eIF2α和肌醇需要酶α（IRE1α）是ER應激的兩個主要標志物。為了觀察膿毒癥時ER壓力的變化，我們檢測了膿毒癥后不同時期PERK和eIF2α、p-PERK和p-eIF2α以及IRE1α的總表達量。膿毒癥誘導了CLP術后2h至24h肺內(nèi)PERK和eIF2α蛋白的磷酸化（圖2），而PERK和eIF2α的總蛋白水平無顯著差異（圖2）。此外，敗血癥刺激了ER相關蛋白IRE1α在2小時至24小時內(nèi)的表達（圖2）。p-PERK和p-eIF2α以及IRE1α的表達峰值出現(xiàn)在CLP后12h，12h與其他時間點相比有顯著差異（圖2）。這些結果表明，膿毒癥通過PERK和eIF2α蛋白的磷酸化誘導ER應激，IRE1α的增加具有時間依賴性。

2.TM和4-PBA對敗血癥小鼠肺組織中ERS相關蛋白的影響

圖3：4-苯基丁酸（PBA）和TM對敗血癥小鼠肺內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激途徑的影響。在CLP前給小鼠腹腔注射4-苯基丁酸（40毫克/千克），CLP12小時后收集肺部樣本。通過Western印跡檢測總PERK（A）和eIF2α（A）、p-PERK（A和B）和peIF2α（A和C）、CHOP（A和G）、ATF（A和F）、IRE1α（A和D）和XBP1（A和E）蛋白的表達。

為了進一步探討ERS在敗血癥中的影響，研究人員使用ERS的抑制劑和誘導劑4-PBA和曲卡霉素（TM）來治療CLP或假手術后的小鼠。結果顯示，CLP誘導了膿毒癥小鼠肺組織中PERK和eIF2α的磷酸化，并增加了CHOP、ATF4、IRE1α和XBP1的表達（圖3）。重要的是，與CLP組相比，給藥4-PBA能顯著減少ERS的發(fā)生，與CLP組相比，CLP術后PERK和eIF2α的磷酸化以及CHOP、ATF4、IRE1α和XBP1的表達均受到抑制（圖3）。相反，與CLP組相比，TM對ERS相關蛋白有增強作用（圖3）。這些結果表明，4-PBA和TM分別抑制和增強了敗血癥中ERS的激活。

3.ERS調(diào)節(jié)膿毒癥小鼠重要器官和組織的自噬活性

圖4：4-PBA和TM對膿毒癥小鼠自噬相關蛋白和重要器官的影響。CLP前腹腔注射4-PBA和TM，CLP12小時后收集肺、肝和腎樣本。通過Western印跡檢測敗血癥小鼠肺（A和D）、肝（B和E）和腎（C和F）組織中LC3、Beclin1、PINK1和Parkin的表達。給小鼠實施中電手術和注射4-PBA和TM后，用透射電子顯微鏡觀察自噬體（G）。黃色箭頭表示雙膜自噬體或自溶體。

之前的研究結果表明，敗血癥會刺激ERS和自噬的發(fā)生和發(fā)展。在此，為了研究ERS對膿毒癥小鼠肺、肝和腎組織中自噬途徑活性的影響，小鼠在CLP手術前接受了4-PBA和TM治療。從數(shù)據(jù)中，我們發(fā)現(xiàn)CLP引發(fā)了肺、肝和腎組織中自噬蛋白LC3II、Beclin1、PINK1和Parkin增加（圖4A、B、C、D、E和F）。TM，ERS誘導劑抑制LC3II、Beclin1、PINK1和Parkin與CLP組的比較（圖4），而ERS抑制劑4-PBA逆轉(zhuǎn)了TM對化膿癥中LC3II、Beclin1、PINK1和Parkin的表達增加小鼠（圖4A，B，C，D，E和F）。與這些結果一致，我們還利用TEM觀察了雙膜自噬體的形成和自噬體空泡的數(shù)量。中電誘導的敗血癥誘導了自噬活性并增加了自噬體的數(shù)量（圖G和H）。與CLP組相比，當4-PBA進一步增加自噬體數(shù)量時，TM抑制了CLP操作誘導的自噬體數(shù)量（圖4G和H）?；谶@些發(fā)現(xiàn)，ERS增加了敗血癥誘導的自噬活性。

4.缺失ERS可減輕敗血癥小鼠肺、肝和腎的組織損傷和功能障礙

圖5：4-PBA和TM對敗血癥小鼠重要器官病理損傷的影響。給小鼠腹腔注射4-PBA和TM后，在CLP12小時后收集肺、肝和腎樣本。通過蘇木精和伊紅（H&E）染色檢測肺、肝和腎的病理變化（A，放大100倍）。計算損傷評分水平（B、C和D）。

圖6：4-PBA和TM對敗血癥小鼠重要器官功能的影響。給小鼠腹腔注射4-PBA和TM后再進行CLP。術后12小時檢測肺MPO活性（A）、BLA總蛋白（B）、肺W/D（C）、ALT（D）、AST（E）、Cr（F）和BUN（G）。分析小鼠的存活率（CLP手術前、手術后1d、2d、3d、5d和7d）（H）。

與我們之前的研究一致，膿毒癥誘導肺、肝、腎組織學損傷并導致器官功能障礙（圖5和圖6）。有趣的是，當對膿毒癥小鼠給予4-PBA時，與CLP組相比，敗血小鼠的組織病理學改變，如水腫、出血、組織炎癥細胞浸潤、肝細胞變性或氣球變性、肝細胞局灶性壞死、腎小球腫脹和腎小球炎癥細胞等，減弱，組織學損傷評分降低（圖5A，B、C和D）。此外，與CLP組相比，CLP+4-PBA組敗血癥引起的BLA總蛋白、MPO活性、肺W/D、血清AST和ALT（肝功能異常的標志物）、血清Cr和BUN（腎功能的常規(guī)指標）的增加在4-PBA治療后有所緩解（圖6A、B、C、D、E、F和G）。然而，TM治療逆轉(zhuǎn)了4-PBA對敗血癥組織病理學改變和器官功能障礙的保護作用（圖6A、B、C、D、E、F和G）。

隨后，我們檢測了ERS抑制劑是否能提高敗血癥小鼠的存活率。與CLP組相比，給予4PBA能顯著提高膿毒癥小鼠的存活率，而在CLP+TM組，TM會降低小鼠的存活率（圖5H）。