材料與方法：

動物、敗血癥模型和實(shí)驗(yàn)程序：

所有研究均使用8-10周齡雄性C57BL/6小鼠。小鼠在特定的無病原體條件下飼養(yǎng)，水和飼料自由供應(yīng)。在全身麻醉的情況下，進(jìn)行1至2厘米的中線開腹手術(shù)以暴露盲腸。然后在回盲瓣遠(yuǎn)端結(jié)扎盲腸，并用18號針頭穿刺。盲腸內(nèi)容物從穿刺的盲腸中擠出，然后將穿刺的盲腸放回腹腔。腹壁切口分層縫合后，注入1mL預(yù)熱生理鹽水進(jìn)行液體復(fù)蘇。假小鼠的處理方式與中毒性腹腔注射操作程序相同，但不進(jìn)行腸道結(jié)扎和穿刺。這項(xiàng)工作已按照ARRIVE準(zhǔn)則進(jìn)行了報(bào)告。

實(shí)驗(yàn)程序：

實(shí)驗(yàn)1：小鼠接受假手術(shù)或CLP手術(shù)，以建立敗血癥模型。在小鼠接受手術(shù)前、手術(shù)后2小時、8小時、12小時和24小時采集肺組織。用Western印跡法檢測總PERK和eIF2α、p-PERK和p-eIF2α以及IRE1α。

實(shí)驗(yàn)2：小鼠隨機(jī)分為四組：Con組、CLP組、CLP+TM組和CLP+4-PBA組。手術(shù)前1小時分別腹腔注射2mg/kg或40mg/kgBW的TM和4-PBA。術(shù)后12h檢測血清中的肺MPO活性、BLA總蛋白、肺W/D、ALT、AST、Cr和BUN。術(shù)后12h采集肺、肝和腎組織。取部分肺組織，用Western印跡法檢測總PERK和eIF2α、p-PERK和p-eIF2α、CHOP、ATF6、IRE1α和XBP1蛋白。用部分肺、肝和腎組織進(jìn)行Western印跡檢測LC3、Beclin1、PINK1和Parkin。用部分肝臟組織通過TEM檢測自噬體或自溶體。部分肺、肝和腎組織通過H&E染色進(jìn)行器官損傷評分。分析小鼠術(shù)前、術(shù)后1d、2d、3d、5d和7d的存活率。

實(shí)驗(yàn)3：小鼠隨機(jī)分為四組：Con組、CLP組、CLP+3-MA組和CLP+Rap組。手術(shù)前1小時分別腹腔注射雷帕霉素或3-MA，劑量為10毫克/千克或15毫克/千克體重。收集肺、肝和腎組織，在手術(shù)后12小時用Western印跡法檢測p-PERK和p-eIF2α、CHOP、ATF6、IRE1α和XBP1。

實(shí)驗(yàn)4：小鼠隨機(jī)分為五組：Con組、CLP組、CLP+H2組、CLP+H2+3-MA組和CLP+H2+TM組。在假手術(shù)和CLP手術(shù)后1小時和6小時腹腔注射富含H2-的生理鹽水（5mL/kg）。TM和3-MA處理同實(shí)驗(yàn)2和3。術(shù)后12h檢測血清中的肺MPO活性、BLA總蛋白、肺W/D、ALT、AST、Cr和BUN。采集部分肺組織，用Western印跡法檢測NF-κb，用ELISA法檢測細(xì)胞因子TNF-α、IL1β、IL-6和HMGB1的表達(dá)。部分肺、肝和腎組織經(jīng)H&E染色進(jìn)行器官損傷評分。分析小鼠術(shù)前、術(shù)后1d、2d、3d、5d和7d的存活率。

詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方案見圖1。

富氫鹽水（HRS）的生產(chǎn)和管理：

根據(jù)我們之前的方法，使用氫氣產(chǎn)生裝置在高壓（0.4兆帕）下將氫氣溶解在0.9%的NaCl中4小時，使其達(dá)到過飽和狀態(tài)。飽和富含H2的生理鹽水保存在無死體積的鋁袋中，在4°C常壓下儲存，并用γ輻射滅菌。按照Hayashida等人發(fā)表的方法，使用針式氫氣電極（UnisenseA/S，丹麥奧胡斯）檢測生理鹽水中的H2濃度。富含H2的生理鹽水每周新鮮配制一次，以確保濃度為0.6mmol/L。

器官組織病理學(xué)檢查：

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，收集肺、肝和腎組織以檢測器官形態(tài)的變化。獲得的組織在10%緩沖福爾馬林中固定至少48小時，用石蠟包埋，并用蘇木精和伊紅染色觀察。使用ImageJ和Microsuite顯微鏡對切片進(jìn)行評估。肺臟、肝臟和腎臟的組織學(xué)改變由病理學(xué)家進(jìn)行盲法評估。器官的評分標(biāo)準(zhǔn)與我們之前發(fā)表的文章相同。

肺髓過氧化物酶（MPO）活性測定：

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采集肺組織以檢測MPO活性。對組織進(jìn)行灌注、勻漿和離心，收集的上清液使用商業(yè)試劑盒通過分光光度計(jì)在590納米波長下按照制造商的說明進(jìn)行測量。

肺W/D重量比：

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，切除肺組織，剁碎，快速吸干，并按濕重稱重。然后將樣本放入60°C的烘箱中烘烤24小時，再次稱量干重。使用W/D重量比檢測肺水腫。

BAL總蛋白測定：

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，結(jié)扎一側(cè)肺，用20mL/kg冷無菌磷酸鹽緩沖鹽水（PBS；pH7.2-7.4）沖洗另一側(cè)肺三次。洗液在4°C下以1000×g離心10分鐘。制備上清液，使用商業(yè)試劑盒和微孔板閱讀器在450/540納米波長下檢測總蛋白。

肝功能和腎功能檢測：

小鼠的肝功能（丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶[ALT]和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶[AST]）和腎功能（血尿素氮[BUN]和血清肌酐[Cr]）是使用商業(yè)ELISA試劑盒和自動臨床化學(xué)分析儀按照制造商的說明進(jìn)行測定的。

存活率：

術(shù)后第1、2、3、5和7天，在每天的同一時間點(diǎn)記錄小鼠的存活或死亡情況。

ELISA檢測：

采用ELISA法檢測血漿中的細(xì)胞因子。TNF-α、IL-1β、IL-6和HMGB1的檢測采用特定的ELISA試劑盒，微孔板閱讀器按照制造商的說明進(jìn)行。

透射電子顯微鏡觀察：

采集肝臟組織，切成1立方厘米的小塊，浸泡在固定液（2.5%戊二醛）中過夜。清洗后，將組織固定在10%的緩沖戊二醛和1%的滲透酸中，脫水后嵌入Epon812中。之后，切片并在透射電子顯微鏡下觀察。通過計(jì)算每個細(xì)胞中自噬體的數(shù)量對結(jié)果進(jìn)行量化。

Western印跡分析：

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后收集肺、肝和腎組織。樣本在冰上勻漿，4℃下15,000×g離心30分鐘，然后用RIPA裂解液裂解。用雙喹啉酸測定法測定所有樣本的蛋白質(zhì)濃度。等量蛋白質(zhì)在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠上分離，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上。在37°C下用阻斷緩沖液（5%脫脂奶）阻斷1小時后，用以下一抗孵育薄膜：洗膜后，用辣根過氧化物酶結(jié)合的第二抗體進(jìn)行孵育，37℃下1.5小時。膜洗凈后用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑顯影。用QuantityOne系統(tǒng)軟件分析印跡灰度值。以β-肌動蛋白或組蛋白作為蛋白質(zhì)樣品的負(fù)載對照，目標(biāo)印跡與參考條帶的灰度比值被視為蛋白質(zhì)的相對表達(dá)水平。

統(tǒng)計(jì)分析：

存活率采用費(fèi)雪精確檢驗(yàn)概率法進(jìn)行分析。所有研究數(shù)據(jù)均以平均值±SEM表示。使用GraphPadPrism對多組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，然后進(jìn)行Tukey多重比較檢驗(yàn)。當(dāng)P值小于0.05時，認(rèn)為組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。