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材料與方法:
動物、敗血癥模型和實(shí)驗(yàn)程序:
所有研究均使用8-10周齡雄性C57BL/6小鼠。小鼠在特定的無病原體條件下飼養(yǎng),水和飼料自由供應(yīng)。在全身麻醉的情況下,進(jìn)行1至2厘米的中線開腹手術(shù)以暴露盲腸。然后在回盲瓣遠(yuǎn)端結(jié)扎盲腸,并用18號針頭穿刺。盲腸內(nèi)容物從穿刺的盲腸中擠出,然后將穿刺的盲腸放回腹腔。腹壁切口分層縫合后,注入1mL預(yù)熱生理鹽水進(jìn)行液體復(fù)蘇。假小鼠的處理方式與中毒性腹腔注射操作程序相同,但不進(jìn)行腸道結(jié)扎和穿刺。這項(xiàng)工作已按照ARRIVE準(zhǔn)則進(jìn)行了報(bào)告。
實(shí)驗(yàn)程序:
實(shí)驗(yàn)1:小鼠接受假手術(shù)或CLP手術(shù),以建立敗血癥模型。在小鼠接受手術(shù)前、手術(shù)后2小時、8小時、12小時和24小時采集肺組織。用Western印跡法檢測總PERK和eIF2α、p-PERK和p-eIF2α以及IRE1α。
實(shí)驗(yàn)2:小鼠隨機(jī)分為四組:Con組、CLP組、CLP+TM組和CLP+4-PBA組。手術(shù)前1小時分別腹腔注射2mg/kg或40mg/kgBW的TM和4-PBA。術(shù)后12h檢測血清中的肺MPO活性、BLA總蛋白、肺W/D、ALT、AST、Cr和BUN。術(shù)后12h采集肺、肝和腎組織。取部分肺組織,用Western印跡法檢測總PERK和eIF2α、p-PERK和p-eIF2α、CHOP、ATF6、IRE1α和XBP1蛋白。用部分肺、肝和腎組織進(jìn)行Western印跡檢測LC3、Beclin1、PINK1和Parkin。用部分肝臟組織通過TEM檢測自噬體或自溶體。部分肺、肝和腎組織通過H&E染色進(jìn)行器官損傷評分。分析小鼠術(shù)前、術(shù)后1d、2d、3d、5d和7d的存活率。
實(shí)驗(yàn)3:小鼠隨機(jī)分為四組:Con組、CLP組、CLP+3-MA組和CLP+Rap組。手術(shù)前1小時分別腹腔注射雷帕霉素或3-MA,劑量為10毫克/千克或15毫克/千克體重。收集肺、肝和腎組織,在手術(shù)后12小時用Western印跡法檢測p-PERK和p-eIF2α、CHOP、ATF6、IRE1α和XBP1。
實(shí)驗(yàn)4:小鼠隨機(jī)分為五組:Con組、CLP組、CLP+H2組、CLP+H2+3-MA組和CLP+H2+TM組。在假手術(shù)和CLP手術(shù)后1小時和6小時腹腔注射富含H2-的生理鹽水(5mL/kg)。TM和3-MA處理同實(shí)驗(yàn)2和3。術(shù)后12h檢測血清中的肺MPO活性、BLA總蛋白、肺W/D、ALT、AST、Cr和BUN。采集部分肺組織,用Western印跡法檢測NF-κb,用ELISA法檢測細(xì)胞因子TNF-α、IL1β、IL-6和HMGB1的表達(dá)。部分肺、肝和腎組織經(jīng)H&E染色進(jìn)行器官損傷評分。分析小鼠術(shù)前、術(shù)后1d、2d、3d、5d和7d的存活率。
詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方案見圖1。
富氫鹽水(HRS)的生產(chǎn)和管理:
根據(jù)我們之前的方法,使用氫氣產(chǎn)生裝置在高壓(0.4兆帕)下將氫氣溶解在0.9%的NaCl中4小時,使其達(dá)到過飽和狀態(tài)。飽和富含H2的生理鹽水保存在無死體積的鋁袋中,在4°C常壓下儲存,并用γ輻射滅菌。按照Hayashida等人發(fā)表的方法,使用針式氫氣電極(UnisenseA/S,丹麥奧胡斯)檢測生理鹽水中的H2濃度。富含H2的生理鹽水每周新鮮配制一次,以確保濃度為0.6mmol/L。
器官組織病理學(xué)檢查:
實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,收集肺、肝和腎組織以檢測器官形態(tài)的變化。獲得的組織在10%緩沖福爾馬林中固定至少48小時,用石蠟包埋,并用蘇木精和伊紅染色觀察。使用ImageJ和Microsuite顯微鏡對切片進(jìn)行評估。肺臟、肝臟和腎臟的組織學(xué)改變由病理學(xué)家進(jìn)行盲法評估。器官的評分標(biāo)準(zhǔn)與我們之前發(fā)表的文章相同。
肺髓過氧化物酶(MPO)活性測定:
實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,采集肺組織以檢測MPO活性。對組織進(jìn)行灌注、勻漿和離心,收集的上清液使用商業(yè)試劑盒通過分光光度計(jì)在590納米波長下按照制造商的說明進(jìn)行測量。
肺W/D重量比:
實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,切除肺組織,剁碎,快速吸干,并按濕重稱重。然后將樣本放入60°C的烘箱中烘烤24小時,再次稱量干重。使用W/D重量比檢測肺水腫。
BAL總蛋白測定:
實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,結(jié)扎一側(cè)肺,用20mL/kg冷無菌磷酸鹽緩沖鹽水(PBS;pH7.2-7.4)沖洗另一側(cè)肺三次。洗液在4°C下以1000×g離心10分鐘。制備上清液,使用商業(yè)試劑盒和微孔板閱讀器在450/540納米波長下檢測總蛋白。
肝功能和腎功能檢測:
小鼠的肝功能(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶[ALT]和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶[AST])和腎功能(血尿素氮[BUN]和血清肌酐[Cr])是使用商業(yè)ELISA試劑盒和自動臨床化學(xué)分析儀按照制造商的說明進(jìn)行測定的。
存活率:
術(shù)后第1、2、3、5和7天,在每天的同一時間點(diǎn)記錄小鼠的存活或死亡情況。
ELISA檢測:
采用ELISA法檢測血漿中的細(xì)胞因子。TNF-α、IL-1β、IL-6和HMGB1的檢測采用特定的ELISA試劑盒,微孔板閱讀器按照制造商的說明進(jìn)行。
透射電子顯微鏡觀察:
采集肝臟組織,切成1立方厘米的小塊,浸泡在固定液(2.5%戊二醛)中過夜。清洗后,將組織固定在10%的緩沖戊二醛和1%的滲透酸中,脫水后嵌入Epon812中。之后,切片并在透射電子顯微鏡下觀察。通過計(jì)算每個細(xì)胞中自噬體的數(shù)量對結(jié)果進(jìn)行量化。
Western印跡分析:
實(shí)驗(yàn)結(jié)束后收集肺、肝和腎組織。樣本在冰上勻漿,4℃下15,000×g離心30分鐘,然后用RIPA裂解液裂解。用雙喹啉酸測定法測定所有樣本的蛋白質(zhì)濃度。等量蛋白質(zhì)在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠上分離,然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上。在37°C下用阻斷緩沖液(5%脫脂奶)阻斷1小時后,用以下一抗孵育薄膜:洗膜后,用辣根過氧化物酶結(jié)合的第二抗體進(jìn)行孵育,37℃下1.5小時。膜洗凈后用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑顯影。用QuantityOne系統(tǒng)軟件分析印跡灰度值。以β-肌動蛋白或組蛋白作為蛋白質(zhì)樣品的負(fù)載對照,目標(biāo)印跡與參考條帶的灰度比值被視為蛋白質(zhì)的相對表達(dá)水平。
統(tǒng)計(jì)分析:
存活率采用費(fèi)雪精確檢驗(yàn)概率法進(jìn)行分析。所有研究數(shù)據(jù)均以平均值±SEM表示。使用GraphPadPrism對多組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,然后進(jìn)行Tukey多重比較檢驗(yàn)。當(dāng)P值小于0.05時,認(rèn)為組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。