3總結(jié)

本研究首次構(gòu)建了一種新型酸反應抗癌納米藥物AB MSN，利用瘤內(nèi)酸微環(huán)境原位控釋H2，降低瘤內(nèi)過量表達的ROS水平，達到抗癌目的。我們充分利用載體MSN的高比表面積和對原藥AB的強氫鍵吸附，獲得了130.6mg/g的超高H2負載能力，是傳統(tǒng)H2溶劑脂質(zhì)體納米藥物的1370倍以上。我們觀察到，在四種不同的磷酸鹽緩沖溶液(pH=5.0、5.8、6.8、7.4)中，PBS的酸度越高，H2的釋放速度越快。在pH=6.8的微酸性PBS(模擬瘤內(nèi)酸性微環(huán)境)中，納米藥物實現(xiàn)了H2的持續(xù)釋放；而在pH=7.4的PBS(模擬正常環(huán)境)中，由于MSN和AB之間的氫鍵作用使其穩(wěn)定，納米藥物沒有釋放H2。納米藥物在細胞內(nèi)釋放的H2能降低癌細胞中過度表達的ROS，從而表現(xiàn)出選擇性抗癌的特點。AB MSN納米藥物在體外和體內(nèi)只對癌細胞造成傷害，而對正常細胞和組織沒有任何影響，能有效抑制腫瘤生長，具有很高的生物安全性。

4實驗步驟

4.1載體MSN的合成

載體MSN是以十六烷基三甲基氯化銨(CTAC)為表面活性劑和孔隙形成劑，正硅酸四乙酯(TEOS)為硅源，三乙醇胺(TEA)為水解催化劑和沉淀劑合成的。首先，將CTAC(25wt.%，10mL)和三乙醇胺(TEAH，20%，1.5mL)依次溶解于88.5mL水中，在95℃下充分攪拌。1小時后，滴加7.5mL TEOS，混合物再攪拌1小時。離心收集產(chǎn)物，依次用100mL乙醇(EtOH)、(1mL 37%HCl+100mL EtOH)和EtOH洗滌一次。然后用鹽酸乙醇溶液萃取MSN孔中的CTAC三次。最后，將得到的MSN分散到水中。

4.2 AB MSN納米藥物的構(gòu)建與表征

將66毫克AB完全溶解在200升10毫克/毫升的MSN水溶液中，然后在14,000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下離心10分鐘，收集AB MSN納米藥物。除去上層清液，將新鮮收集的AB MSN納米藥物用于后續(xù)實驗。用掃描電鏡和電子顯微鏡測量了MSN的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。用衰減全反射傅立葉變換紅外光譜(ATR-FTIR)檢測AB、MSN和AB MSN的分子結(jié)構(gòu)。傅立葉變換紅外光譜由Thermo-Nicolet Nexus 670 ATR-IR光譜儀采集。根據(jù)傅立葉變換紅外光譜，AB MSN納米藥物顯示出AB和MSN的特征峰組合。

4.3測量MSN的AB負載能力

通過比較AB和MSN的紅外特征透射強度，計算出MSN的AB負載能力。首先，按AB與MSN的不同摩爾比(1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1)制備AB與MSN的混合物，并用AB的摩爾百分比/(AB+MSN)繪制標準曲線。收集了AB和MSN混合物的傅立葉變換紅外光譜。記錄了它們在2330nm和1088nm處的透射強度(I2330nm，I1088nm)，這分別是AB和MSN的特征峰，互不干擾。I2330nm/I1088nm與AB/(AB+MSN)摩爾百分比的標準曲線進行線性擬合，得到函數(shù)y=-0.90757X+1.42648。記錄新收集的AB MSN納米藥物的傅立葉變換紅外光譜，得到其I2330nm/I1088nm值，并根據(jù)上述標準曲線計算MSN的AB負載能力。經(jīng)計算，MSN的AB負載能力高達每克MSN 653毫克AB。

4.4在不同pH值的磷酸鹽緩沖溶液中測量AB和AB MSN納米藥物的H2釋放量

首先，制備四種不同pH值(pH=5.0、5.8、6.8和7.4)的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)。將收集到的AB MSN納米藥物平均分散到四份100mL不同pH值(pH=5.0、5.8、6.8和7.4)的N2-staurated PBS中，并立即密封反應容器。將氫氣微電極(Unisense)立即放入AB MSN的PBS溶液中，以監(jiān)測H2的釋放。

4.5檢測AB MSN納米藥物的細胞內(nèi)H2釋放量

用亞甲基藍(MB)和鉑納米粒子(～3nm)組成的探針檢測AB MSN納米藥物的細胞內(nèi)H2釋放，因為在鉑納米粒子的催化作用下，MB被H2還原時，其藍色會迅速減弱。664nm處吸光度的降低與H2的量呈線性關系。使用Bio-Tek微孔板閱讀器在96孔板中測量MB溶液的標準曲線(圖S1)，用于量化MB的還原和H2的釋放。探針溶液由濃度分別為300和13.9g/mL的甲基溴和鉑納米粒子混合配制而成。將探針溶液(10升)加入已用100升培養(yǎng)基培養(yǎng)HeLa細胞24小時的96孔板的每個孔中。通過顯微鏡觀察可以發(fā)現(xiàn)，由于細胞呈藍色，MB和鉑幾乎全部滲入細胞。然后排干溶液，用PBS沖洗一次，在每個孔中加入100g/mL的納米藥物培養(yǎng)基溶液。培養(yǎng)一定時間后，使用Bio-Tek微孔板閱讀器追蹤664納米波長處的吸光度(MB吸收峰)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著時間的推移，664納米波長處的吸光度逐漸下降，直至處理后75分鐘。與此同時，我們堅持在幾個特定的孔中定性測量細胞內(nèi)的H2。我們在三個典型的時間點(0分鐘、60分鐘、90分鐘)用顯微鏡拍攝了幾張數(shù)碼照片。照片顯示，隨著時間的推移，細胞的顏色逐漸變淡，這表明納米藥物在細胞中持續(xù)產(chǎn)生了H2。

4.6檢測細胞內(nèi)ROS水平

使用ROS試劑盒檢測細胞內(nèi)ROS水平。將HeLa細胞(1×104個細胞/孔)種植在96孔板中。培養(yǎng)24h后，用100L含有100g/mLAB MSN的新鮮培養(yǎng)基取代每孔中的培養(yǎng)基，然后按照ROS試劑盒的說明在每孔上方加入10LROS試劑。培養(yǎng)一段時間后，使用Bio-Tek微孔板閱讀器(ex:488nm,em:525nm)記錄熒光強度。未處理AB MSN納米藥物的細胞孔作為空白對照。樣品與對照組在488納米波長處的熒光強度差被用來表示細胞內(nèi)ROS水平的變化，反映了釋放的H2對ROS的減少作用。

4.7 AB MSN納米藥物的細胞毒性測定

使用CCK-8試劑盒測量細胞毒性。在細胞水平上，我們以HeLa(宮頸癌)、B16-F10(黑色素瘤)和U87(神經(jīng)母細胞瘤)細胞作為三種腫瘤細胞模型，以HEK-293細胞作為正常細胞模型，測試了游離原藥AB、載體MSN、分解產(chǎn)物B(OH)2ONH4和AB MSN納米藥物的細胞毒性。首先，將上述四種細胞以1×104個/孔的密度種植在96孔板中，并用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37?C和5%CO2的濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至細胞充滿孔面積的90%。用PBS(對照)、濃度為0-100g/mL的MSN、B(OH)2ONH4、AB或AB MSN溶液替換培養(yǎng)基。培養(yǎng)24小時后，在每個孔中加入10升CCK8。培養(yǎng)24小時后，在每個孔中加入10升CCK-8溶液。再培養(yǎng)1小時后，使用Bio-Tek微孔板閱讀器讀數(shù)(吸收波長450nm)。與空白對照相比，細胞毒性以細胞存活率的百分比表示。每個數(shù)據(jù)以8個獨立實驗(n=8)的平均值±標準偏差表示。

4.8腫瘤小鼠模型的體內(nèi)抗腫瘤效果

將3×107個HeLa細胞注入Balb/c雌性裸鼠(16-20克，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心)后肢，建立HeLa腫瘤小鼠模型。待腫瘤平均體積達到約100mm3后，將腫瘤小鼠隨機分為5組×5只，分別注射AB MSN納米藥物(16.5mg/mL，PBS)、MSN載體(10mg/mL，PBS，MSN濃度相等)、游離藥物AB(0.65毫克/毫升，與AB MSN相比為AB濃度的1/10)、分解產(chǎn)物B(OH)2ONH4(16.6毫克/毫升，與AB MSN相比為等量AB濃度)以及作為空白對照的PBS(100升)。在給定的時間點，用游標卡尺測定腫瘤大小，腫瘤體積的計算公式為：1/2×長×寬2。深圳大學動物實驗管理委員會批準了所有動物實驗方案。

4.9血色素和伊紅(H&E)染色組織學檢查

在進行H&E染色組織學檢查時，所有小鼠均被人道處死，并在治療三周后收獲主要器官(心、肝、脾、肺和腎)，用4%的聚甲醛溶液固定，并用石蠟包埋進行H&E染色。