在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)之前，我們檢查了充氧循環(huán)是否會(huì)引起細(xì)胞水平的測(cè)量溫度或拉伸發(fā)生變化。

內(nèi)皮傷口愈合試驗(yàn)。在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)前，按照之前的報(bào)道對(duì)培養(yǎng)孔進(jìn)行紫外線滅菌，并在膜表面涂上0.1mg/ml膠原I。然后在培養(yǎng)室的每個(gè)孔中加入在1毫升完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基中含有約110,000個(gè)HAEC的懸浮液。每孔中播種的細(xì)胞來(lái)自T-25燒瓶中生長(zhǎng)的HAEC亞培養(yǎng)物的胰蛋白酶化。細(xì)胞播種后，在20%氧氣、5%二氧化碳和37℃的濕潤(rùn)細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到細(xì)胞達(dá)到匯合(16小時(shí))。然后，用無(wú)菌的200μl移液管吸頭劃傷內(nèi)皮細(xì)胞單層，并用1×PBS沖洗去除細(xì)胞碎片。隨后，棄去PBS，取而代之的是完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基。最后，將培養(yǎng)裝置置于帶溫度控制(37℃)的培養(yǎng)箱中，并連接到氣體攪拌器，使細(xì)胞暴露于恒定(1%、4%、13%或20%O2)或不同頻率(0.6、6或60個(gè)周期/小時(shí))和量程范圍(13-4%O2或20-1%O2)的氧氣濃度循環(huán)變化中24小時(shí)(所有情況下二氧化碳濃度均保持在5%)。對(duì)于任何給定的條件，都包括一個(gè)平行對(duì)照組(持續(xù)13%的氧氣，5%的二氧化碳)，以進(jìn)一步規(guī)范傷口愈合率。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的傷口愈合測(cè)量在六個(gè)不同的日子里重復(fù)進(jìn)行(n=6/實(shí)驗(yàn)組)。

為評(píng)估內(nèi)皮傷口愈合過(guò)程，在劃傷后(0小時(shí))和實(shí)驗(yàn)結(jié)束后(24小時(shí))立即測(cè)量傷口面積。為此，將培養(yǎng)系統(tǒng)放置在配有電荷耦合器件相機(jī)(C9100)的倒置顯微鏡的電動(dòng)平臺(tái)上，使用10倍物鏡記錄每個(gè)孔的相位對(duì)比圖像。鑒于宏觀內(nèi)皮傷口大于單個(gè)圖像區(qū)域的面積，因此通過(guò)NIS軟件v4.10.00中相應(yīng)工具自動(dòng)獲取的九個(gè)相鄰區(qū)域的復(fù)合生成來(lái)獲得完整的傷口圖像。使用ImageJ軟件(http://imagej.nih.gov/ij/)測(cè)量，通過(guò)比較每個(gè)內(nèi)皮傷口的初始面積和最終面積來(lái)評(píng)估傷口閉合情況。簡(jiǎn)而言之，由一名不知道治療組的研究人員使用自由選擇工具在所有圖像中標(biāo)記傷口邊緣。測(cè)量每個(gè)樣本在兩個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的傷口面積，并計(jì)算傷口閉合的百分比變化。對(duì)于每種實(shí)驗(yàn)條件，通過(guò)將面積變化百分比與連續(xù)暴露于13%O2的細(xì)胞對(duì)應(yīng)的面積變化百分比進(jìn)行歸一化，計(jì)算出傷口閉合指數(shù)。

結(jié)果

圖2內(nèi)皮傷口愈合試驗(yàn)。相位對(duì)比圖像示例，顯示實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)(t=0小時(shí))和細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后，在持續(xù)暴露于13%O2氧氣(上圖)和4%O2氧氣(下圖)條件下的細(xì)胞單層傷口。黃線和紅線分別表示初始和最終傷口邊界。在這個(gè)具有代表性的例子中，氧氣濃度為13%時(shí)，傷口閉合面積減少了20.5%，氧氣濃度為4%時(shí)，傷口閉合面積減少了44.7%。比例尺為500μm。

圖2舉例說(shuō)明了培養(yǎng)物暴露于13%O2和4%O2時(shí)的內(nèi)皮傷口愈合過(guò)程，顯示24小時(shí)后，細(xì)胞單層修復(fù)在缺氧條件下得到加強(qiáng)。內(nèi)皮單層最初形成的傷口寬度重復(fù)性很強(qiáng)：總體為1.033±0.016mm(平均值SE)，比較不同實(shí)驗(yàn)組(間歇缺氧的頻率和幅度)，未觀察到初始傷口寬度的顯著差異。

圖3恒定氧氣濃度下的內(nèi)皮傷口閉合指數(shù)。與作為對(duì)照的13%氧氣相比，細(xì)胞暴露于4%氧氣時(shí)傷口愈合率明顯增加。

圖3顯示了恒定氧合水平下的分組結(jié)果。雖然內(nèi)皮修復(fù)在20%O2和13%O2濃度下總體相似，但在4%O2濃度下，內(nèi)皮修復(fù)出現(xiàn)了相當(dāng)大的增長(zhǎng)(約兩倍)。然而，雖然在1%氧氣濃度下觀察到了類似的傷口閉合反應(yīng)(與13%氧氣濃度相比，有增加38%的趨勢(shì))，但它顯著低于4%氧氣濃度(26%)(P=0.036；n=6/實(shí)驗(yàn)組)。

圖4間歇性缺氧(IH)下的內(nèi)皮傷口閉合指數(shù)。間歇缺氧的頻率和振幅范圍都會(huì)引起傷口愈合的顯著變化。低頻IH(0.6次/小時(shí))加速了4-13%幅值范圍內(nèi)的內(nèi)皮傷口愈合，而模擬嚴(yán)重OSA的高頻IH模式(60次/小時(shí))并沒(méi)有明顯改變傷口閉合，與氧氣水平無(wú)關(guān)。數(shù)據(jù)歸一化為連續(xù)13%氧氣條件下的數(shù)據(jù)。

內(nèi)皮傷口閉合顯示出很大的差異，這取決于IH挑戰(zhàn)的幅度和頻率(圖4)。與參考值(恒定13%氧氣)相比，以0.6次/小時(shí)的最低頻率使用13%-4%氧氣波動(dòng)的循環(huán)可使內(nèi)皮傷口愈合加快102%(P=0.009)。圖4還顯示，當(dāng)IH采用20-1%的周期性氧合擺動(dòng)時(shí)，與13-4%的擺動(dòng)相比，傷口閉合率有所降低。更具體地說(shuō)，在6個(gè)周期/小時(shí)和0.6個(gè)周期/小時(shí)時(shí)，傷口閉合率分別降低了74%(P<0.001)和44%(P=0.029)。模擬嚴(yán)重OSA的高頻IH模式的事件發(fā)生率(60次/小時(shí))并未顯著改變內(nèi)皮傷口的閉合，無(wú)論氧合擺動(dòng)幅度如何(即20-1%或13-4%O2)。

討論

這項(xiàng)研究提供了初步證據(jù)，證明細(xì)胞培養(yǎng)模型中的主動(dòng)脈內(nèi)皮傷口愈合受到用于模擬OSA的特定IH范例的很大影響。值得注意的是，研究結(jié)果表明，氧壓振蕩的頻率和范圍在細(xì)胞對(duì)損傷的集體反應(yīng)中起著重要作用。

IH對(duì)細(xì)胞的影響已通過(guò)多種缺氧/復(fù)氧模式進(jìn)行了評(píng)估，同時(shí)采用了改變培養(yǎng)物上方氣室中氧氣濃度的傳統(tǒng)方法。然而，由于氧氣在液體培養(yǎng)基中的擴(kuò)散速度較慢，這種方法只能可靠地應(yīng)用非常低的循環(huán)速率(通常為幾分鐘到幾小時(shí))，這與OSA患者典型的缺氧/復(fù)氧事件頻率明顯不同。此外，在細(xì)胞培養(yǎng)的常規(guī)IH環(huán)境中實(shí)施與OSA相關(guān)的循環(huán)速率會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞PO2水平與細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)空氣空間中的PO2水平大相徑庭，從而提供誤導(dǎo)性的研究結(jié)果和結(jié)論。因此，除了作者實(shí)際控制或測(cè)量細(xì)胞水平氧合的少量研究外，迄今為止還沒(méi)有廣泛研究過(guò)OSA相關(guān)頻率下IH對(duì)細(xì)胞的影響。最近設(shè)計(jì)的一種實(shí)驗(yàn)方法可以精確控制定義IH曲線的細(xì)胞氧合參數(shù)(圖1)，它使我們能夠證實(shí)一個(gè)假設(shè)，即內(nèi)皮傷口愈合實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞反應(yīng)明顯依賴于IH特性。此外，我們還探索了各種模擬嚴(yán)重(60次/小時(shí))和輕度(6次/小時(shí))OSA的IH頻率，以及與之前一些報(bào)告中采用的IH頻率類似的非常慢的頻率(0.6次/小時(shí))。如此低的IH循環(huán)頻率事實(shí)上并不是在模擬OSA，而是在模擬氧合變化，如腫瘤內(nèi)發(fā)生的氧合變化。另一方面，我們研究了不同的缺氧/復(fù)氧振幅范圍：一個(gè)是文獻(xiàn)中常用的范圍(20-1%O2)，另一個(gè)是與嚴(yán)重OSA時(shí)主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞體內(nèi)氧擺動(dòng)條件相吻合的范圍(13-4%O2)。

在不同恒定氧合水平下獲得的內(nèi)皮傷口愈合反應(yīng)(圖3)表明，與正常氧合水平(13%O2)相比，在OSA(4%O2)的實(shí)際但非常嚴(yán)重的缺氧值下，內(nèi)皮修復(fù)顯著增強(qiáng)。然而，值得注意的是，在1%O2的缺氧水平下，傷口愈合明顯低于4%O2的水平，而這一水平是一些IH研究中通常假設(shè)的，但即使在嚴(yán)重OSA中，對(duì)于大動(dòng)脈內(nèi)皮來(lái)說(shuō)也是不現(xiàn)實(shí)的。因此，我們的研究結(jié)果表明，內(nèi)皮傷口愈合的細(xì)胞反應(yīng)與測(cè)試反應(yīng)的缺氧嚴(yán)重程度并不成正比。因此，我們的研究結(jié)果可以作為一個(gè)說(shuō)明性例子，反對(duì)缺氧程度越深，細(xì)胞反應(yīng)越強(qiáng)的簡(jiǎn)單概念。這些來(lái)自持續(xù)缺氧的數(shù)據(jù)還指出了在與每種細(xì)胞類型和體內(nèi)龕位的微環(huán)境相類似的氧飽和度值下測(cè)試細(xì)胞的重要性?？紤]到生理正常氧合水平明顯取決于相關(guān)組織，從骨髓的1%到肺泡上皮細(xì)胞和動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的13%不等，這一點(diǎn)尤為重要。因此，傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)假設(shè)大氣中的氧氣濃度為20%O2相當(dāng)于細(xì)胞的常氧狀態(tài)顯然是有問(wèn)題的，因?yàn)閷?duì)于幾乎所有培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)說(shuō)，從生理角度來(lái)看，這種氧合水平顯然是高氧的。具體到內(nèi)皮細(xì)胞，值得注意的是，13%的氧氣水平對(duì)動(dòng)脈內(nèi)皮來(lái)說(shuō)是合理的常氧水平，但對(duì)通常處于40mmHg氧壓(~5%)的靜脈內(nèi)皮來(lái)說(shuō)卻是生理性高氧水平，而且這種水平實(shí)際上相當(dāng)于OSA中動(dòng)脈內(nèi)皮所經(jīng)歷的最嚴(yán)重缺氧。在這方面，值得注意的是，在間歇性缺氧的動(dòng)物中，對(duì)于周期性動(dòng)脈氧飽和度降低的幅度，細(xì)胞微環(huán)境中的局部分壓水平因組織/器官(如腦、肝、肌肉、脂肪和睪丸)的不同而有很大差異。

本研究最重要的發(fā)現(xiàn)是傷口愈合率在很大程度上取決于IH模式(圖4)。當(dāng)細(xì)胞處于OSA(13%-4%O2)下主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的實(shí)際氧合波動(dòng)時(shí)，極低(0.6次/小時(shí))的修復(fù)率是正常氧合水平(13%O2)的兩倍。有趣的是，當(dāng)循環(huán)速率接近重度OSA(60次/小時(shí))時(shí)，傷口愈合與常氧對(duì)照相似，這表明快速缺氧循環(huán)并不一定意味著更高的細(xì)胞反應(yīng)。值得注意的是，當(dāng)缺氧擺動(dòng)幅度(20%-1%O2)比OSA中這種特殊細(xì)胞類型的實(shí)際擺動(dòng)幅度(13%-4%O2)更大時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞的恢復(fù)往往會(huì)減弱，尤其是在0.6和6個(gè)周期/小時(shí)的頻率下。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)并不支持IH波動(dòng)越劇烈，細(xì)胞反應(yīng)越強(qiáng)的觀點(diǎn)。為此，圖4提供了一個(gè)視角，說(shuō)明內(nèi)皮傷口愈合的進(jìn)展如何因IH范例而異(傷口閉合指數(shù)大約在四倍范圍內(nèi)變化)。換句話說(shuō)，由于IH的這些頻率和振幅范圍涵蓋了以前在OSA文獻(xiàn)中使用的一些實(shí)驗(yàn)條件，如果不注意特定的周期性缺氧條件，可能會(huì)得出相互矛盾的結(jié)論：IH可能對(duì)內(nèi)皮修復(fù)有益、有害或沒(méi)有任何影響(圖4)。因此，通過(guò)微調(diào)IH實(shí)驗(yàn)條件獲得的結(jié)果強(qiáng)烈表明，至少在OSA領(lǐng)域的體外研究中，需要精確劃分細(xì)胞所經(jīng)歷的IH的確切模式，IH模式的選擇應(yīng)盡可能模擬每種細(xì)胞類型在體內(nèi)所經(jīng)歷的病理生理氧合條件。

在對(duì)OSA中的細(xì)胞反應(yīng)提出的許多具體相關(guān)問(wèn)題中，我們選擇了主動(dòng)脈內(nèi)皮傷口愈合范例作為例子，而不是試圖闡明與任何特定OSA相關(guān)的發(fā)病機(jī)制，主要目的是確定細(xì)胞反應(yīng)對(duì)IH范例的依賴程度。心血管改變是增加OSA患者發(fā)病率和死亡率的最重要后果之一。特別是，實(shí)驗(yàn)和臨床研究都清楚地表明，內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)受到IH的影響，但肥胖、年齡和同源性反應(yīng)等其他因素也會(huì)發(fā)揮作用。在這種情況下，要保持正常的內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和功能，就需要修復(fù)機(jī)制能夠正常運(yùn)行并對(duì)損傷做出適當(dāng)反應(yīng)。我們?cè)隗w外研究中獲得的結(jié)果表明，就修復(fù)過(guò)程而言，IH和持續(xù)低氧似乎都能在全球范圍內(nèi)發(fā)揮保護(hù)作用(但有很大程度的可變性)，傷口愈合的整體增加就是證明。至于內(nèi)皮傷口愈合的基本機(jī)制如何受到周期性缺氧/復(fù)氧的頻率和程度的影響，還需要等待進(jìn)一步的研究，這顯然超出了本研究的范圍。

盡管如此，我們?nèi)杂斜匾?jiǎn)要回顧并從概念上討論不同的反應(yīng)是如何根據(jù)具體的缺氧模式而發(fā)生的。內(nèi)皮傷口愈合與其他多種細(xì)胞生理反應(yīng)類似，是一個(gè)機(jī)制非常復(fù)雜的過(guò)程，尤其是在隨時(shí)間變化的微環(huán)境條件下。簡(jiǎn)單地說(shuō)，細(xì)胞單層修復(fù)涉及兩個(gè)主要的一般細(xì)胞過(guò)程(遷移和增殖)。體內(nèi)內(nèi)皮傷口愈合的數(shù)據(jù)表明，細(xì)胞遷移先于細(xì)胞增殖，在本研究實(shí)驗(yàn)的時(shí)間范圍內(nèi)(24小時(shí))，傷口愈合主要是由細(xì)胞遷移引起的。然而，細(xì)胞遷移和增殖都是由多個(gè)分子級(jí)聯(lián)的上調(diào)/下調(diào)驅(qū)動(dòng)的，而每個(gè)細(xì)胞內(nèi)的氧合時(shí)間過(guò)程會(huì)進(jìn)一步影響這些分子級(jí)聯(lián)。就心血管系統(tǒng)的具體情況而言，據(jù)報(bào)道，上游和下游生物標(biāo)志物都會(huì)受到IH的調(diào)節(jié)，而且在某些情況下會(huì)受到與持續(xù)缺氧不同的調(diào)節(jié)。低氧誘導(dǎo)因子(HIF)1和2以及NF-B都會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和炎癥途徑以及內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞凋亡對(duì)IH做出反應(yīng)。此外，IH還會(huì)引起促炎細(xì)胞因子和脂肪因子的基因表達(dá)和分泌發(fā)生變化，影響一氧化氮偶聯(lián)、內(nèi)皮素-1和內(nèi)皮素受體，并增加血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的循環(huán)水平。在IH的這種情況下，每個(gè)細(xì)胞對(duì)時(shí)變環(huán)境的反應(yīng)可能涉及慢反應(yīng)和快反應(yīng)機(jī)制，它們分別主要由整個(gè)周期的平均缺氧程度以及缺氧循環(huán)的速率和幅度驅(qū)動(dòng)。事實(shí)上，有研究表明，在一些細(xì)胞中，上游反應(yīng)因子(如HIF-1和HIF-2)可分別對(duì)恒定缺氧或循環(huán)缺氧做出選擇性反應(yīng)。此外，再氧合的持續(xù)時(shí)間會(huì)調(diào)節(jié)小鼠氧化應(yīng)激的誘導(dǎo)。因此，隨著循環(huán)頻率的增加，慢反應(yīng)機(jī)制的相對(duì)重要性會(huì)降低，而快反應(yīng)機(jī)制則會(huì)產(chǎn)生相反的效果。還應(yīng)考慮到，除循環(huán)頻率外，細(xì)胞氧分壓的最大值和最小值也可能調(diào)節(jié)細(xì)胞反應(yīng)的程度，這可能解釋了為什么頻率的增加會(huì)因缺氧/再氧的擺動(dòng)范圍不同而產(chǎn)生不同的效果(圖4)。在主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的特殊情況下，我們發(fā)現(xiàn)除了最高的IH頻率(60次/小時(shí))外(缺氧時(shí)間可能不足以發(fā)生轉(zhuǎn)錄變化)，傷口愈合只對(duì)這些細(xì)胞在體內(nèi)經(jīng)歷的范圍內(nèi)的氧合機(jī)制有反應(yīng)。具體來(lái)說(shuō)，從13%的生理值到嚴(yán)重病理情況下動(dòng)脈血水平的合理預(yù)期值(低至4%)。有趣的是，這種增強(qiáng)內(nèi)皮修復(fù)的"甜蜜點(diǎn)"對(duì)于連續(xù)性和IH都是存在的。

然而，除了IH在單個(gè)細(xì)胞中引發(fā)的反應(yīng)外，多細(xì)胞的綜合集體反應(yīng)也在傷口愈合中發(fā)揮作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)，在參與炎癥反應(yīng)的重要上游因子(如NF-B)中，動(dòng)態(tài)刺激(振蕩輸入和生物噪聲)可在很大程度上調(diào)節(jié)全球綜合細(xì)胞反應(yīng)。此外，最近也有報(bào)道稱，由于涉及細(xì)胞間的交流，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞集體遷移(如傷口愈合的基礎(chǔ)機(jī)制)的機(jī)制與驅(qū)動(dòng)孤立細(xì)胞遷移的機(jī)制并不完全相同。由于細(xì)胞交流機(jī)制(即細(xì)胞-細(xì)胞接觸、通過(guò)細(xì)胞骨架收縮在細(xì)胞外基質(zhì)中傳遞張力或旁分泌)表現(xiàn)出特定的時(shí)間反應(yīng)特征，因此有理由期待氧合的動(dòng)態(tài)條件也能調(diào)節(jié)綜合的集體傷口愈合細(xì)胞反應(yīng)的時(shí)間特征。遺憾的是，我們目前對(duì)細(xì)胞集體反應(yīng)所涉及的不同機(jī)制如何受動(dòng)態(tài)氧合變化調(diào)節(jié)的了解幾乎為零，因?yàn)榇蠖鄶?shù)研究都集中在單細(xì)胞個(gè)體途徑或恒定氧合條件下的集體過(guò)程。最后，應(yīng)該考慮到的是，在體內(nèi)，細(xì)胞對(duì)IH的反應(yīng)不僅是這種挑戰(zhàn)對(duì)細(xì)胞直接引起的反應(yīng)，而且還通過(guò)循環(huán)可溶性因子或免疫細(xì)胞釋放到血液中的間接影響作為對(duì)IH的全身反應(yīng)。在這方面，以前有關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)據(jù)清楚地表明，用反復(fù)氣道阻塞的大鼠或睡眠呼吸暫停患者的血清培養(yǎng)細(xì)胞，可調(diào)節(jié)傷口愈合?？紤]到仍有許多問(wèn)題有待解決，我們相信，目前實(shí)驗(yàn)中采用的實(shí)驗(yàn)方法應(yīng)能幫助未來(lái)的研究闡明精確定義的IH范式如何調(diào)節(jié)單個(gè)和集體的綜合細(xì)胞反應(yīng)過(guò)程。

總之，這項(xiàng)研究強(qiáng)調(diào)了在模擬OSA的大量IH特征的背景下，與內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)反應(yīng)相關(guān)的深遠(yuǎn)差異，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了精確劃分每時(shí)每刻細(xì)胞氧合特征的重要性。此外，我們?cè)谥鲃?dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞傷口愈合中的發(fā)現(xiàn)強(qiáng)烈表明，有必要調(diào)整實(shí)驗(yàn)IH范例，以可靠地再現(xiàn)影響體內(nèi)每種特定細(xì)胞類型的缺氧水平。