腸道微生物群涉及復雜的代謝相互作用，包括分解和再利用宿主和飲食來源的營養(yǎng)物質(zhì)。對這些資源的競爭可以限制病原體的生長。然而，一些腸道病原菌可以通過目前尚不清楚的機制侵入這一生態(tài)位。利用沙門氏菌腹瀉的小鼠模型和轉(zhuǎn)座子突變體篩選，我們發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella Typhimurium,S.Tm）在未受干擾的腸道中的初始生長是由S.Tm的hyb氫化酶(hyb hydrogenase)驅(qū)動的，該酶促進消耗氫氣（H?）——這是微生物群代謝的一個核心中間產(chǎn)物。在競爭性感染實驗中，與野生型S.Tm相比，hyb突變體在感染早期表現(xiàn)出生長缺陷（約降低100倍；p<0.05）。但在抗生素介導的宿主微生物群破壞后，這些差異消失。此外，將耗氫菌引入微生物群會干擾依賴hyb的S.Tm生長。因此，H?是微生物群代謝的一個阿喀琉斯之踵(Achilles'heel)，可被病原體利用，并可能為預防感染提供機會。

哺乳動物的腸道內(nèi)密集定殖著微生物，統(tǒng)稱為微生物群。微生物群具有一個代謝活動網(wǎng)絡，促進將復雜的飲食和宿主來源的碳水化合物高效分解為短鏈脂肪酸（SCFAs）、氫氣（H?）和二氧化碳。微生物發(fā)酵產(chǎn)物隨后被交叉喂養(yǎng)的次級發(fā)酵菌消耗、被宿主吸收或釋放到環(huán)境中。腸道生態(tài)系統(tǒng)入侵(Gut ecosystem invasion)在本文中定義為病原體（或任何其他新來者）在宿主腸道中的初始生長階段。在此階段，腸道黏膜看起來健康，微生物群（仍然）完整，并限制了營養(yǎng)可用性。這阻止了大多數(shù)新到達細菌的生長。盡管營養(yǎng)可用性稀缺，腸道病原體仍能入侵腸道生態(tài)系統(tǒng)。然而，使腸道病原體能夠“入侵腸道生態(tài)系統(tǒng)”的機制在很大程度上仍不清楚。

人類食源性病原體鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella Typhimurium,S.Tm）是腹瀉的病原體，可以在這種營養(yǎng)耗竭的環(huán)境中生長到高數(shù)量并引發(fā)疾病。動物實驗證實，腸道管腔內(nèi)的病原體密度必須達到每克糞便10?-10?菌落形成單位（cfu）才會引發(fā)腸病。由于低至103-10?細菌的接種量足以在人類中引起腹瀉疾病，我們推測S.Tm可以在面對完整的微生物群和健康的腸道時進行初始生長。S.Tm在這個密集定殖的生態(tài)位中生長的機制仍然是個謎。這種機制可以使用“低復雜度微生物群”（low complex microbiota,LCM）小鼠進行研究，這種小鼠允許S.Tm在腸道管腔內(nèi)生長。LCM小鼠是前無菌小鼠，最初被接種了“改變的沙德勒菌群”的菌株，并允許小至200個菌落形成單位（cfu）的接種量在腸道管腔內(nèi)定殖。在感染后的頭2天內(nèi)，沒有腸病的跡象，病原體生長到每克糞便10?-10?cfu（腸道生態(tài)系統(tǒng)入侵）。當病原體達到每克糞便10?-101?cfu的最終密度時，在感染后第3-4天引發(fā)黏膜炎癥。因此，LCM小鼠為分析宿主腸道定殖的所有階段（包括腸道生態(tài)系統(tǒng)入侵）提供了一個獨特的模型。

Unisense氫氣微電極系統(tǒng)的應用

Unisense微電極被用于測量小鼠盲腸腔內(nèi)的氫氣（H?）濃度，使用了Unisense氫氣微電極（H?-50），其尖端直徑為50微米。處死小鼠后，取盲腸及回腸、大腸，固定于含2%瓊脂的培養(yǎng)皿底層，并覆蓋45°C的2%瓊脂頂層以固定組織。使用26號針頭在組織上打孔，以便微電極尖端能夠穿透盲腸腔在每個盲腸中，使用氫氣微電極分別在盲腸尖端、中段和與小腸、大腸連接處測量了三個不同位置的氫氣濃度。氫氣微電極測量不同小鼠模型（包括無菌小鼠、低復雜微生物群小鼠和傳統(tǒng)小鼠）盲腸中的氫氣濃度，發(fā)現(xiàn)只有存在微生物群的小鼠盲腸中存在高水平的氫氣，而無菌小鼠的盲腸中未檢測到氫氣。

實驗結(jié)論

鼠傷寒沙門氏菌（S.Tm）在腸道生態(tài)系統(tǒng)入侵的初始階段依賴于其hyb氫化酶來利用氫氣（H?）。氫氣是腸道微生物群代謝的產(chǎn)物，S.Tm通過消耗氫氣獲得能量，從而在腸道微生物群的密集定殖環(huán)境中獲得生長優(yōu)勢。實驗表明，S.Tm的hyb氫化酶僅在感染的前24小時內(nèi)（即腸道生態(tài)系統(tǒng)入侵的初始階段）是必需的。在這個階段，S.Tm利用氫氣作為能量來源，能夠在未受干擾的腸道微生物群中生長。而在感染后期，當腸道炎癥被觸發(fā)后，氫氣的利用不再對S.Tm的生長起關鍵作用。通過引入消耗氫氣的細菌，可以干擾依賴hyb的S.Tm生長，這表明氫氣是微生物群代謝的一個潛在弱點，可能被病原體利用，也可能為預防感染提供機會。通過對不同宿主的微生物群基因組分析，發(fā)現(xiàn)幾乎所有可用的腸道微生物群基因組都顯示出氫氣生成途徑的證據(jù)，表明氫氣的利用可能是腸道病原體入侵的一個普遍策略。

圖1.hyb-氫化酶突變體在腸道生態(tài)系統(tǒng)入侵中表現(xiàn)出缺陷。(A)將hyb-氫化酶突變體與氫化酶正常的同源菌株S.TmWT按1:1比例混合（5×10?cfu，經(jīng)灌胃），并感染五只天真的LCM小鼠。通過平板計數(shù)測定糞便中兩種菌株的負荷，并計算競爭指數(shù)（C.I.）。(B)Lipocalin-2 ELISA監(jiān)測實驗期間的炎癥發(fā)生。箱線圖表示第一四分位數(shù)和第三四分位數(shù)，須表示最小值和最大值。

圖2、S.Tm僅在非炎癥早期階段從H2中獲益。(A)在五只LCM小鼠中進行競爭指數(shù)實驗，檢測S.Tmavir hyd3在體內(nèi)的適應性。ns表示不顯著（p≥0.05），**表示p<0.01，Mann-Whitney U檢驗。(B)第4天p.i.盲腸組織病理評分，對組織進行HE染色并評估炎癥情況。(C)第1天和第4天分別通過平板計數(shù)測定S.Tmavir hyd3和S.Tmavir的糞便載量。*p<0.05，配對數(shù)據(jù)進行單側(cè)Wilcoxon符號秩檢驗（虛線表示配對關系）。

圖3、S.Tm氫化酶突變體在腸道入侵缺陷與微生物產(chǎn)生的H2有關。(A)測定盲腸腔中H?濃度，在三個不同位置進行測量，并修正H?S的電極交叉敏感性（每組3只小鼠）。(B)在五只無菌小鼠中進行S.Tmavir hyd3與S.Tmavir的C.I.實驗（5×10?cfu，灌胃，第1天p.i.分析）。(C)在天真的LCM小鼠或鏈霉素預處理小鼠中進行S.Tmhyd3與S.TmWT的C.I.實驗（每組10/5只小鼠，第1天p.i.分析）。(D)在天真的CON小鼠或鏈霉素處理小鼠中進行相同實驗（每組5只小鼠）。(E)第1天p.i.的盲腸組織病理評分。(F)第1天p.i.對競爭菌株的負荷進行平板計數(shù)分析。

圖4、S.Tmavir hyd3在天真的LCM和CON小鼠中定植能力受損。(A)八只天真的LCM小鼠或(B)七只天真的CON小鼠分別感染S.Tmavir或S.Tmavir hyd3（5×10?cfu，灌胃），在第1天p.i.測定糞便載量。

圖5、引入氫氣消耗者干擾S.Tm通過hyb途徑的腸道入侵。(A)實驗策略。(B)LCM小鼠預先定殖氫氣消耗菌株S.Tmavir（實驗組）或不能消耗氫氣的突變體S.Tmavir hyd3（對照組）（5×10?cfu，灌胃，提前1天）。通過平板計數(shù)確認定殖效果。隨后用S.Tmavir與S.Tmavir hyd3按1:1比例混合（5×10?cfu，灌胃）再次感染（每組5只小鼠），第1天p.i.測定競爭指數(shù)。

結(jié)論與展望

本研究利用小鼠沙門氏菌腹瀉模型和轉(zhuǎn)座子突變體篩選，發(fā)現(xiàn)沙門氏菌Typhimurium（S.Tm）在未擾動的腸道中的初期生長依賴于其hyb氫化酶，該酶能促進氫氣（H?）的利用，而氫氣正是腸道菌群代謝中的核心中間產(chǎn)物。在競爭性感染實驗中，與野生型S.Tm相比，hyb突變株在感染早期的生長顯著受限，但當抗生素破壞宿主菌群后，這一差異消失。此外向腸道菌群中引入消耗氫氣的細菌也會干擾hyb依賴的S.Tm生長。因此，氫氣作為腸道菌群代謝的“阿喀琉斯之踵”可以被病原體利用，同時也可能成為預防感染的新靶點。Unisense微電極被用于測量小鼠盲腸腔內(nèi)的氫氣（H?）濃度，以驗證微生物群產(chǎn)生的氫氣是否為鼠傷寒沙門氏菌（S.Tm）入侵腸道生態(tài)系統(tǒng)提供能量支持。研究人員通過unisense氫氣微電極高精度的氫氣濃度測量，為理解腸道微生物群與病原體之間的代謝相互作用提供了直接的證據(jù)。本研究揭示了氫氣在鼠傷寒沙門氏菌入侵腸道生態(tài)系統(tǒng)中的關鍵作用，并指出氫氣是腸道微生物群代謝的一個潛在弱點，可能被病原體利用。通過調(diào)節(jié)氫氣的可用性，可以為預防腸道病原體感染提供新的策略。