4討論

多篇研究和綜述論文表明，土霉菌菌絲的形態(tài)發(fā)育是影響洛伐他汀產(chǎn)量的最重要因素之一。其重要性首先與底物(尤其是氧氣)的可用性有關(guān)，氧氣進(jìn)入菌絲團(tuán)聚體的運(yùn)輸受到擴(kuò)散的限制。由于真菌形態(tài)在土霉菌生產(chǎn)洛伐他汀過程中的重要性，MPEC被用于研究土霉菌生產(chǎn)洛伐他汀的過程。在這項(xiàng)工作中，MPEC被首次用于控制攪拌罐生物反應(yīng)器中的真菌形態(tài)，該反應(yīng)器同時(shí)以分批和連續(xù)補(bǔ)料模式運(yùn)行。在此之前，這種方法僅用于搖瓶培養(yǎng)。

4.1形成洛伐他汀的最佳肉湯氧飽和度

目前的研究結(jié)果表明，在生產(chǎn)洛伐他汀的過程中，肉湯中的氧飽和度有一個(gè)最佳控制水平。此前，只有Lai等人研究了肉湯中氧飽和度在10%至40%范圍內(nèi)的影響；他們發(fā)現(xiàn)分批實(shí)驗(yàn)中的最佳值為20%。Casas Lopez等人和Rodriguez Porcel等人聲稱，肉湯中氧的飽和度越高(高達(dá)400%)，洛伐他汀的滴度越好，這就是他們使用富氧空氣生產(chǎn)洛伐他汀的原因。與此相反，Bizukojc和Ledakowicz警告說，持續(xù)的高通氣率可能會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生八酮副產(chǎn)物，如(+)-geodin。在目前的工作中，pO2=35%是連續(xù)分批補(bǔ)料工藝的最佳值，而40%(這些實(shí)驗(yàn)中pO2的最高控制水平)是分批工藝的最佳值。然而，3.1節(jié)所述實(shí)驗(yàn)中獲得的最佳洛伐他汀滴度并不令人滿意(即仍低于100mg LOV/l)，即使與我們之前在同一生物反應(yīng)器中進(jìn)行的pO2=20%的實(shí)驗(yàn)相比也是如此。

這里得到的最佳pO2水平與Lai等人和Bizukojc和Ledakowicz報(bào)告的不同，可能有兩種解釋：第一，培養(yǎng)基成分不同；第二，從顆粒大小、顆粒結(jié)構(gòu)和肉湯中游離菌絲的數(shù)量來看，土霉菌的形態(tài)發(fā)生了變化。在土霉菌生產(chǎn)洛伐他汀的過程中，人們很少關(guān)注肉湯中的碳源濃度與提供足夠的氧氣使其氧化的關(guān)系。Lai等人使用的培養(yǎng)基(即更高濃度的乳糖和酵母提取物)比我們在本研究中使用的培養(yǎng)基濃度更高。在上述Casas Lopez等人和Rodriguez Porcel等人的研究中，使用了超過100g LAC/l的培養(yǎng)基和富氧空氣，但作者并未顯示乳糖濃度隨時(shí)間的變化。只有Bizukojc和Gonciarz證明，可用氧氣和碳底物之間的比例是高效生產(chǎn)洛伐他汀的關(guān)鍵因素。重要的是，不僅要避免出現(xiàn)圖1G所示的分批培養(yǎng)現(xiàn)象，即乳糖缺乏導(dǎo)致洛伐他汀滴度下降，還要避免出現(xiàn)圖1I所示的分批補(bǔ)料培養(yǎng)現(xiàn)象，即過量補(bǔ)料碳底物。

將pO2維持在過高的水平可能會(huì)導(dǎo)致洛伐他汀的濃度過低，這是因?yàn)樗璧母咄馑俾屎蛿嚢杷俣葧?huì)對(duì)菌絲造成損害。在目前的工作中，pO2為40%的連續(xù)分批補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)就屬于這種情況，顆粒的崩解最終導(dǎo)致洛伐他汀滴度偏低。令人驚訝的是，文獻(xiàn)中很少涉及機(jī)械應(yīng)力問題，只有Rodriguez Porcel等人以有限的方式比較了土霉菌在攪拌罐生物反應(yīng)器和漿柱中的生長情況。他們跟蹤了這些類型的生物反應(yīng)器中不同流體動(dòng)力條件對(duì)顆粒直徑、蓬松度和生物量濃度的影響，但沒有提供有關(guān)洛伐他汀滴度的數(shù)據(jù)。

4.2顆粒內(nèi)氧氣濃度對(duì)洛伐他汀產(chǎn)量的影響

只有在設(shè)定的20%氧氣水平下，才有可能保持纖毛蟲的顆粒形態(tài)，并獲得顆粒內(nèi)氧氣濃度的數(shù)據(jù)。以前在搖床中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，只有直徑小于1400μm的最小顆粒才能完全被氧氣穿透。在這里的攪拌罐生物反應(yīng)器中，即使在較小的顆粒(約1000μm)中也觀察到了零氧氣濃度，但只有在T01運(yùn)行的緊密顆粒中才有。對(duì)于T02運(yùn)行中較松散的顆粒，為避免顆粒中氧氣濃度為零而設(shè)定的直徑上限(約1400μm)大致得到了證實(shí)。Bizukojc和Gonciarz提出的最終結(jié)論，即通氣性更好的顆?？纱_保更高的洛伐他汀滴度，在生物反應(yīng)器系統(tǒng)中也得到了證實(shí)。

顆粒內(nèi)氧濃度水平還與活性生物量有關(guān)，而活性生物量又與特定真菌產(chǎn)生代謝物和酶的能力有關(guān)。以前，通過對(duì)產(chǎn)生洛伐他汀和葡萄糖淀粉酶的曲霉進(jìn)行圖像分析，量化了顆粒外層以及氧含量較高的層中的活性生物量。然而，在本實(shí)驗(yàn)中，盡管培養(yǎng)前制備方法的改變導(dǎo)致了顆粒大小和結(jié)構(gòu)的改變，但洛伐他汀滴度的增加并沒有預(yù)期的那么高。

綜上4.1和4.2，可以說培養(yǎng)液的通氣對(duì)洛伐他汀的生物合成非常重要，但真菌的形態(tài)是更重要的因素。Bizukojc和Ledakowicz以前曾在搖瓶中發(fā)現(xiàn)，顆粒的大小會(huì)影響洛伐他汀的生物合成。后來的研究和目前的實(shí)驗(yàn)(其中測量了顆粒內(nèi)的氧濃度曲線)證明，顆粒大小對(duì)洛伐他汀生產(chǎn)的影響是由于氧擴(kuò)散的阻力和顆粒內(nèi)的氧含量造成的。

4.3形態(tài)工程改善洛伐他汀的生產(chǎn)

上一節(jié)表明，有必要控制生物反應(yīng)器中菌絲的大小。我們可以采用傳統(tǒng)的方法，如改變孢子數(shù)量或在生物反應(yīng)器中誘導(dǎo)更高的剪切應(yīng)力。第一種方法對(duì)土曲霉很有效。第二種方法在Casas Lopez等人的實(shí)驗(yàn)中并不成功，因?yàn)閷⑷~輪轉(zhuǎn)速從300轉(zhuǎn)/分鐘提高到800轉(zhuǎn)/分鐘會(huì)導(dǎo)致形成的被破壞顆粒變小，洛伐他汀滴度降低。如上所述，本文介紹的補(bǔ)料批次培養(yǎng)物中的洛伐他汀滴度降低是由于顆粒的破壞，尤其是在較高的pO2設(shè)置(40%)和長時(shí)間培養(yǎng)的情況下。

之前的MPEC搖瓶培養(yǎng)結(jié)果很有希望，因?yàn)楫?dāng)預(yù)培養(yǎng)液中滑石粉濃度為12g/l時(shí)，肉湯中的洛伐他汀濃度增加了一倍。在當(dāng)前工作中進(jìn)行的生物反應(yīng)器研究中，分批系統(tǒng)中的洛伐他汀滴度也增加了一倍，但在甘油補(bǔ)料的連續(xù)補(bǔ)料式系統(tǒng)中，與對(duì)照運(yùn)行相比，洛伐他汀滴度增加了3.5倍。分批補(bǔ)料培養(yǎng)是生產(chǎn)洛伐他汀的最佳系統(tǒng)，但這種長時(shí)間的培養(yǎng)過程很容易因長時(shí)間的機(jī)械應(yīng)力而導(dǎo)致菌絲發(fā)生不希望看到的形態(tài)變化。Pawlak和Bizukojc的研究就證明了這一點(diǎn)。這些作者提出了各種補(bǔ)料方案，但沒有控制真菌形態(tài)。因此，他們獲得的洛伐他汀滴度低于100毫克LOV/l，這些滴度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于目前使用MPEC的工作中獲得的滴度。因此，對(duì)于洛伐他汀的生物合成來說，細(xì)胞內(nèi)的氧氣濃度比培養(yǎng)液中的氧氣濃度更重要。反過來，細(xì)胞內(nèi)氧濃度又取決于土霉菌顆粒的大小和結(jié)構(gòu)。通過MPEC等技術(shù)確保形成小顆粒的土霉菌非常重要，這種技術(shù)可在孢子聚集階段提供適當(dāng)?shù)目刂?。試圖通過傳統(tǒng)的形態(tài)工程技術(shù)獲得小顆粒是沒有用的，例如增加攪拌以提供高剪切應(yīng)力，從而破碎較大的顆粒。

5總結(jié)

可以得出四個(gè)重要結(jié)論。首先，培養(yǎng)液的氧飽和度是影響土霉菌生產(chǎn)洛伐他汀的一個(gè)重要因素。在某些過程中，提高氧飽和度可能會(huì)提高洛伐他汀滴度，除非維持高氧飽和度的方法會(huì)對(duì)真菌形態(tài)產(chǎn)生負(fù)面影響。其次，顆粒內(nèi)氧氣濃度是可能影響土霉菌培養(yǎng)過程中葉伐他汀滴度的另一個(gè)參數(shù)。如果氧氣能更好地滲入顆粒，就能獲得更高的洛伐他汀滴度。第三，顆粒內(nèi)的氧氣水平取決于土霉菌的形態(tài)，即顆粒的大小和結(jié)構(gòu)。因此，菌絲的形態(tài)演變是影響洛伐他汀產(chǎn)量的最重要因素。第四，在攪拌槽生物反應(yīng)器中由于剪切應(yīng)力而形成的分散菌絲不能有效地生產(chǎn)洛伐他汀。只有使用微粒強(qiáng)化培養(yǎng)法，才能獲得穩(wěn)定的小微粒，從而顯著提高洛伐他汀的滴度。因此，要想讓土霉菌高效地進(jìn)行洛伐他汀的生物合成，真菌的形態(tài)學(xué)、菌體的大小、菌絲的大小和菌體的大小都是至關(guān)重要的。因此，要想讓土霉菌高效地進(jìn)行洛伐他汀生物合成，必須在顆粒形成階段對(duì)真菌形態(tài)進(jìn)行控制。