3.3應(yīng)用MPEC改變土霉菌形態(tài)并提高洛伐他汀滴度

圖4、在接種了含有不同濃度滑石粉微粒的預(yù)培養(yǎng)基的分批運行中，生產(chǎn)培養(yǎng)基中(A)洛伐他汀濃度(B)攪拌速度(C)空氣流速(D)肉湯氧飽和度(E)乳糖濃度的時間變化。

為了減小土霉菌顆粒的大小并改變其結(jié)構(gòu)，在批處理模式下用于接種生物反應(yīng)器的預(yù)培養(yǎng)物中添加了不同量的滑石粉(9、12和15克/升)(分別為運行T15、T14和T16)(圖4)。此外，還進行了接種標(biāo)準(zhǔn)預(yù)培養(yǎng)物的對照運行(運行T17)。為了研究微顆粒對洛伐他汀生產(chǎn)的影響，并盡量減少影響真菌形態(tài)的其他因素，這四次運行的攪拌速度具有相同的時間曲線，并手動控制在圖4B所示的水平。這些水平是攪拌肉湯和延遲顆粒破壞(如果發(fā)生的話)的最佳水平。只改變了氣流速率(以保持20%的氧飽和度)。

圖4A顯示了在預(yù)培養(yǎng)基中添加不同濃度滑石粉微粒的批次運行中生產(chǎn)培養(yǎng)基中的洛伐他汀濃度。對于12g/l的滑石粉，洛伐他汀滴度達到115mg LOV/l(運行T14)，是對照運行T17中約50mg LOV/l的兩倍。

在預(yù)培養(yǎng)過程中添加滑石粉微?？纱龠M在隨后的生產(chǎn)培養(yǎng)過程中形成更小的顆粒，因此肯定有利于氧氣進入菌絲體。因此，土霉菌消耗了更多的氧氣(圖4C和D)。在最有效的批次運行T14中，空氣流速不僅在實驗開始時(早期滋養(yǎng)階段)較高，而且在48小時至72小時之間(即晚期滋養(yǎng)階段)也較高。在T14試驗中，空氣流速是所有試驗中最高的，直到96小時，乳糖濃度才達到1.2g LAC/l的低值(圖4E)。此外，在這一實驗中，以及在96小時時乳糖濃度稍高(3克LAC/l，圖4E)的T16實驗中，設(shè)定的20%氧飽和度比其他實驗維持的時間更長(圖4D)。96小時后，乳糖濃度通常會逐漸降低，直到所有實驗結(jié)束。96小時后，所有實驗中pO2的升高都表明真菌的活性降低，這可能是由于乳糖濃度過低(比較圖4D和E)，也可能是由于剪切力破壞了顆粒和菌絲。在對照運行T17中，空氣流速的變化沒有MPEC運行那么大，pO2水平開始上升的時間(72小時之前)也早于MPEC運行。盡管培養(yǎng)基中存在超過11g LAC/l的物質(zhì)，但仍出現(xiàn)了這種情況(圖4E)。在對照組T17中，菌絲被破壞是真菌失去活性的最可能原因。

此外，在MPEC T15和T16運行中，還觀察到一些與通氣有關(guān)的重要現(xiàn)象。在運行T16的前24小時，空氣流速達到上限，而在運行T15時，氧氣飽和度很難保持在20%(圖4D)。這是因為在這些運行中，土霉菌的生長更加分散(沒有大顆粒)，這使得肉湯更加粘稠、更加非牛頓，因此更加難以通氣。

圖5、洛伐他汀、乳糖和甘油濃度以及連續(xù)分批補料工藝(A)在預(yù)培養(yǎng)過程中添加12克/升滑石粉微粒(運行T21)和(B)不添加微粒(對照運行T24)的空氣流速的時間變化。

鑒于在分批處理模式的生物反應(yīng)器中使用滑石微粒能提高洛伐他汀的產(chǎn)量，我們決定測試在連續(xù)補料處理模式的生物反應(yīng)器中使用滑石微粒是否也能提高洛伐他汀的產(chǎn)量。生物反應(yīng)器的這種運行模式通?？梢垣@得高滴度的次級代謝產(chǎn)物，因為與分批模式相比，補料可以避免底物的限制。因此，選擇了以乳糖為初始底物的甘油補料連續(xù)補料批次培養(yǎng)。預(yù)培養(yǎng)使用12克/升滑石粉，因為這在之前的分批實驗中效果最好。48小時后開始投料。

圖5顯示了添加(圖5A)和不添加(圖5B)滑石微粒(分別為實驗T21和T24)的連續(xù)分批補料實驗結(jié)果。實驗條件與間歇實驗類似。攪拌速度采用手動預(yù)設(shè)值，pO2控制在20%?；⒘５募尤胩岣吡寺宸ニ〉牡味龋冶确峙鷮嶒灥牡味忍岣叩酶欤篗PEC工藝(T21)的滴度為253毫克LOV/l，比對照實驗(T24)的滴度高出3.5倍以上?；⒘５倪@種積極作用與培養(yǎng)曲線中的一些差異有關(guān)。首先，在MPEC過程(T21)中，乳糖消耗得更快，在264小時時達到1.5克LAC/l的殘留值。需要注意的是，在補料底物甘油的情況下，情況正好相反，在MPEC運行中甘油的含量更高。其次，在MPEC過程(T21)中，與對照運行T24相比，在整個培養(yǎng)過程中需要更高的空氣流速才能將氧飽和度維持在20%的設(shè)定值上(圖5)。最后但并非最不重要的一點是，滑石微粒的存在所引起的形態(tài)變化最終導(dǎo)致了洛伐他汀產(chǎn)量的增加。

圖6、A.12g/l(B)15g/l(C)9g/l的批次培養(yǎng)和(D)12g/l的分批補料培養(yǎng)中，在土霉菌的預(yù)培養(yǎng)中添加滑石微粒對洛伐他汀滴度比和最大洛伐他汀滴度的影響；水平虛線表示LOV(t)值等于1(微粒無影響)，水平實線表示平均LOV值。

圖6顯示了實驗中每小時的最高洛伐他汀濃度以及洛伐他汀滴度比LOV(t)的值。該比率的計算方法是，在MPEC工藝(運行T14、T15、T16和T21)中，給定小時的洛伐他汀濃度與不含滑石粉微粒的對照運行(分批運行為T17，分批補料運行為T24)中同一小時的洛伐他汀濃度之比。此外，還計算了每次實驗中這一比率的算術(shù)平均值，用LOV表示。

使用滑石粉的分批實驗(T14、T15和T16)在24小時內(nèi)得出的洛伐他汀滴度比值最高(圖6A-C)。然而，這種積極作用隨著培養(yǎng)時間的延長而減弱。盡管如此，T14(T17為對照組)的平均LOV值仍為3.4。在連續(xù)分批進行的T21試驗(T24試驗為對照)中，趨勢有所不同。在工藝開始時幾乎看不到積極的影響，但微粒的存在和生物反應(yīng)器的補料使洛伐他汀滴度比在整個培養(yǎng)過程中保持在一個較高的水平，最終產(chǎn)生了最高的洛伐他汀滴度(超過250毫克LOV/l)。

圖7、使用滑石粉微粒改變預(yù)培養(yǎng)后土霉菌形態(tài)的變化。圖中的不同部分在文中(第3.3節(jié)末尾)有解釋。

使用MPEC后，土霉菌生產(chǎn)洛伐他汀的所有這些積極變化都與顆粒結(jié)構(gòu)和大小的變化有關(guān)。圖7顯示了實驗不同階段的顆粒。首先，滑石微粒的添加導(dǎo)致預(yù)培養(yǎng)的顆粒變小(比較圖7A和B)。在孢子數(shù)量相同的情況下，不添加微顆粒時，預(yù)培養(yǎng)物中顆粒的平均直徑約為500-700米(圖7A)。經(jīng)形態(tài)改造的顆粒至少小三倍(圖7B)。因此，在MPEC培養(yǎng)過程中，生物反應(yīng)器中沒有出現(xiàn)大顆粒(即直徑約為1500-2500米的顆粒)，但在對照實驗的48小時內(nèi)可以看到它們(圖7C)。在不使用滑石粉的情況下，雖然形成了大顆粒，但在許多情況下，它們在運行后期由于剪切應(yīng)力而被破壞，形成分散的形態(tài)(圖7E)。雖然乍一看這種分散的形態(tài)似乎更有利于氧氣的傳輸，但它并不能保證良好的洛伐他汀滴度。經(jīng)過形態(tài)改造的小顆粒大部分未被破壞(觀察到的自由分散的菌絲較少)，而且足夠小(約300-500μm)，這才保證了氧氣能夠很好地進入菌絲(圖7D和F)。因此，為了改善洛伐他汀的生物合成，需要"自然"形成小顆粒和分散的菌絲：這種形態(tài)不應(yīng)該是大顆粒被破壞的結(jié)果?？傊?，微小顆粒因其穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和最小的氧傳遞阻力，是生產(chǎn)洛伐他汀的最佳選擇。