2材料與方法

2.1菌種、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

土曲霉ATCC 20542用于生產(chǎn)洛伐他汀。除非另有說(shuō)明，預(yù)培養(yǎng)基的制備方法如下。將兩個(gè)10天麥芽提取物斜面中的孢子洗到裝有300毫升預(yù)培養(yǎng)基(含一小部分培養(yǎng)基)的燒瓶中。每升中約有109個(gè)孢子。然后將孢子懸浮液分成兩個(gè)工作容積為150毫升的搖瓶。在30℃和110rpm的恒速旋轉(zhuǎn)振蕩器上預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)。在選定的預(yù)培養(yǎng)物中加入規(guī)定量的碳酸鈣(平均直徑為10μm的微顆粒)，以誘導(dǎo)生長(zhǎng)中的菌絲發(fā)生所需的形態(tài)變化。這些經(jīng)過(guò)24小時(shí)培養(yǎng)的300毫升容積的預(yù)培養(yǎng)物被用作5.4升工作容積攪拌罐生物反應(yīng)器的接種物(容積接種比為1:18)，該反應(yīng)器以分批或連續(xù)分批補(bǔ)料模式運(yùn)行。

在所有實(shí)驗(yàn)中，生物反應(yīng)器中的生產(chǎn)培養(yǎng)基都含有作為初始碳源的20克LAC(乳糖)和作為氮源的4克YE(酵母提取物)。在預(yù)培養(yǎng)基中，乳糖濃度為10g LAC/l，酵母提取物濃度為8g YE/l。培養(yǎng)基的詳細(xì)組成見(jiàn)其他文獻(xiàn)。在所有連續(xù)分批補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)中，生物反應(yīng)器從48小時(shí)開(kāi)始就以1.5毫升/小時(shí)的恒定補(bǔ)料速率加入甘油(500g GLY/l)溶液。所有生物反應(yīng)器過(guò)程均在30℃溫度下進(jìn)行。此外，生物反應(yīng)器中的pH值從運(yùn)行24小時(shí)起一直控制在7.8，并使用碳酸氫鈉和碳酸氫鉀溶液。定期添加盡可能低劑量的消泡劑A(Sigma)以防止起泡，起泡在24至48小時(shí)內(nèi)最為嚴(yán)重。實(shí)驗(yàn)分四批進(jìn)行。

在第一批實(shí)驗(yàn)中，批次培養(yǎng)(實(shí)驗(yàn)T09和T10)的肉湯氧飽和度(pO2)設(shè)定為20%和40%，連續(xù)分批進(jìn)行的培養(yǎng)(T01、T04和T06)的肉湯氧飽和度(pO2)設(shè)定為20%、35%和40%。采用級(jí)聯(lián)控制，首先改變空氣流速(從1.5升/分鐘到8升/分鐘)，然后改變攪拌速度(從175轉(zhuǎn)/分鐘到350轉(zhuǎn)/分鐘)。在某些實(shí)驗(yàn)中，只用空氣流速控制pO2(見(jiàn)第3.3節(jié))。

在第二批實(shí)驗(yàn)(T01和T02)中，采用了不同的批次生物反應(yīng)器工藝預(yù)培養(yǎng)準(zhǔn)備方法。在T01試驗(yàn)中，采用了上述標(biāo)準(zhǔn)方法。在T02實(shí)驗(yàn)中，只將一個(gè)斜面上的孢子洗到裝有150毫升預(yù)培養(yǎng)基(含一小部分培養(yǎng)基)的燒瓶中。然后再加入150毫升無(wú)菌培養(yǎng)基。這樣總共有300毫升，分裝在兩個(gè)搖瓶中。如上所述，搖瓶在30℃和110轉(zhuǎn)/分的條件下培養(yǎng)。這一操作減少了孢子的數(shù)量，但沒(méi)有改變體積接種比。

在第三批實(shí)驗(yàn)中，向標(biāo)準(zhǔn)預(yù)培養(yǎng)物中添加滑石微粒，濃度分別為9、12和15g/l(實(shí)驗(yàn)T14、T15和T16)。在進(jìn)行這一系列實(shí)驗(yàn)的同時(shí)，還進(jìn)行了不添加微顆粒的對(duì)照實(shí)驗(yàn)(實(shí)驗(yàn)T17)。

第四批實(shí)驗(yàn)系列包括連續(xù)分批進(jìn)行的補(bǔ)料運(yùn)行，其中使用了滑石微顆粒(12克/升)進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)(實(shí)驗(yàn)T21和T24-對(duì)照)。

2.2分析方法

用紙過(guò)濾器過(guò)濾從培養(yǎng)液中提取的樣品，用蒸餾水洗滌菌絲，在105℃溫度下烘干至恒重，以干重測(cè)定生物量(X)。使用液相色譜法測(cè)定過(guò)濾培養(yǎng)液中的乳糖、甘油(GLY)和洛伐他汀(LOV)濃度。分析前，樣品還需經(jīng)過(guò)0.2μm過(guò)濾器凈化。使用Aquity RP18 1.7m(2×100mm)色譜柱在40℃溫度下檢測(cè)洛伐他汀。洗脫液(水-乙腈，均用0.1%甲酸酸化)流速為0.200ml/min，采用梯度洗脫：0.0-3.0min 60.0:40.0(v/v)3.0-7.0min 40.0:60.0(v/v)。在238納米波長(zhǎng)處檢測(cè)洛伐他汀。乳糖和甘油在Aquity 1.7m(2.1×150mm)酰胺柱中測(cè)定，溫度為35℃。流速為0.290ml/min。等度洗脫，分析物由蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)。

在靜態(tài)條件下，使用安裝在計(jì)算機(jī)控制的電動(dòng)微機(jī)械手(Unisense)上的克拉克型氧氣微電極測(cè)量顆粒中的氧氣濃度曲線。從生物反應(yīng)器中取出顆粒后迅速進(jìn)行測(cè)量。對(duì)測(cè)量氧氣濃度曲線的顆粒進(jìn)行數(shù)字拍照。然后，通過(guò)圖像分析確定其直徑。有關(guān)所有這些測(cè)量的詳細(xì)信息，包括所用方法的優(yōu)點(diǎn)和局限性，已在以前的文章中作了介紹。

氧氣的對(duì)流傳質(zhì)系數(shù)(kLa)和氧氣吸收率(OUR)是通過(guò)動(dòng)態(tài)法測(cè)定的。