摘要

微粒強(qiáng)化培養(yǎng)(MPEC)被用于生產(chǎn)洛伐他汀的土曲霉ATCC 20542的生物反應(yīng)器培養(yǎng)。提高肉湯中的氧飽和度可提高洛伐他汀滴度，但更重要的是顆粒形態(tài)，因?yàn)樵谳^小和較松散的顆粒中，氧氣更容易到達(dá)真菌細(xì)胞。因此，我們改變了顆粒大小，在預(yù)培養(yǎng)基中加入了10μm的滑石微粒。與對照組(不添加微顆粒)相比，這使后續(xù)生產(chǎn)培養(yǎng)物中的洛伐他汀滴度提高了3.5倍，在最佳連續(xù)分批進(jìn)行培養(yǎng)的情況下，滴度達(dá)到250毫克/升。洛伐他汀滴度的顯著提高和微顆粒的低成本使MPEC培養(yǎng)洛伐他汀生產(chǎn)成為一種有吸引力的替代方法。

1引言

在搖瓶和各種生物反應(yīng)器中進(jìn)行浸沒式培養(yǎng)時(shí)，絲狀真菌可以以兩種形態(tài)生長，即分散形態(tài)(游離菌絲、菌塊和顯微顆粒)和球狀菌絲聚集體(被稱為顯微顆粒)。形態(tài)對真菌產(chǎn)生初級和次級代謝產(chǎn)物的方式有重要影響。

顯微顆粒的直徑小于600μm，它們有一個(gè)在顯微鏡下可以觀察到的核心。團(tuán)塊沒有可觀察到的核心，只有糾纏在一起的菌絲，其大小與微觀顆粒相當(dāng)。宏觀球狀顆粒的直徑可達(dá)幾毫米。在形成宏觀球團(tuán)的情況下，基質(zhì)進(jìn)入球團(tuán)的擴(kuò)散傳質(zhì)受到限制，球團(tuán)中心的生物量可能會(huì)失去養(yǎng)分和氧氣。另一方面，如果出現(xiàn)分散形態(tài)，培養(yǎng)液的流變特性就會(huì)變成強(qiáng)烈的非牛頓流體，往往會(huì)降低攪拌效率和氧氣的對流傳遞。目前還不清楚哪種形式能更好地生產(chǎn)工業(yè)代謝物。例如，分散形態(tài)和顆粒形態(tài)是否能促進(jìn)黑曲霉的檸檬酸生物合成就很不清楚。

目前的工作重點(diǎn)是利用土曲霉生產(chǎn)洛伐他汀，這是一種能降低人體內(nèi)源性膽固醇水平的多酮類藥物。在這一過程中，生長形態(tài)與洛伐他汀產(chǎn)量之間的關(guān)系尚不十分清楚。雖然有幾位作者聲稱顆粒形態(tài)更有利于洛伐他汀的生產(chǎn)，但結(jié)果并不確定，因?yàn)榇蠖鄶?shù)培養(yǎng)都是大顆粒和分散菌絲的混合體，沒有純粹分散形態(tài)培養(yǎng)的比較數(shù)據(jù)。無論如何，即使是最理想的顆粒直徑也不明確，因?yàn)椴煌淖髡呓o出的直徑分別為1-1.5毫米和1.6-2毫米。重要的是，流體動(dòng)力條件會(huì)影響這一過程：低速攪拌時(shí)，顆粒直徑為2-2.5毫米，而高速攪拌會(huì)產(chǎn)生剪切應(yīng)力，從而降低生長速度和洛伐他汀的產(chǎn)量。

絲狀微生物形成菌團(tuán)的機(jī)制多種多樣，但在曲霉菌中，凝結(jié)機(jī)制占主導(dǎo)地位，菌團(tuán)是由孢子聚集形成的，從孢子中產(chǎn)生菌絲。通過干擾這種機(jī)制，可以影響真菌在生物反應(yīng)器中的生長形態(tài)，從而提高次生代謝物的產(chǎn)量。這方面的傳統(tǒng)技術(shù)包括調(diào)節(jié)用于預(yù)培養(yǎng)制備或直接接種生產(chǎn)培養(yǎng)基的孢子數(shù)量、改變工藝參數(shù)(如pH和pO2)、改變培養(yǎng)基成分(各種碳源或氮源)，尤其是改變生物反應(yīng)器中的流體動(dòng)力條件，即改變?nèi)~輪和通氣引起的剪切應(yīng)力。不過，近年來也有人提出了現(xiàn)代形態(tài)工程工具。這些工具旨在找到一種方法，以對微生物生理影響最小的方式控制形態(tài)。微粒強(qiáng)化培養(yǎng)(MPEC)就是其中一種工具。這包括在預(yù)培養(yǎng)的肉湯中，甚至在生產(chǎn)培養(yǎng)基本身中添加礦物微粒，如二氧化鈦、氧化鋁或硅酸鎂(滑石粉)。

MPEC是增加絲狀真菌形成酶和次生代謝物的一種良好技術(shù)。MPEC首次被用于提高煙曲霉(Caldariomyces fumago)氯過氧化物酶的產(chǎn)量。后來，Driouch等人的研究表明，無機(jī)微粒(氧化鋁和二氧化鈦)會(huì)影響孢子的聚集過程，并減小黑曲霉顆粒的大小，同時(shí)將酶(淀粉酶和果糖呋喃糖苷酶)的產(chǎn)量提高數(shù)倍。最后，在預(yù)培養(yǎng)過程中加入滑石粉微粒，利用這種技術(shù)提高了黑曲霉的洛伐他汀產(chǎn)量。

已經(jīng)研究了生物反應(yīng)器中培養(yǎng)液的通氣速率和氧氣飽和度對洛伐他汀生物合成的影響，但這些數(shù)值并不能反映顆粒中生物體所經(jīng)歷的氧氣濃度。盡管眾所周知氧氣供應(yīng)會(huì)影響真菌顆粒中代謝物的產(chǎn)生，但很少有人研究過這一現(xiàn)象對土霉菌生產(chǎn)洛伐他汀的影響。有些研究是在燒瓶培養(yǎng)中進(jìn)行的：MPEC可減小顆粒的直徑，使其結(jié)構(gòu)更松散。這樣就能更好地向顆粒中輸送氧氣，提高細(xì)胞的活力和代謝物的形成。另一方面，此類研究尚未在生物反應(yīng)器中進(jìn)行，因?yàn)樯锓磻?yīng)器的流體動(dòng)力學(xué)條件與此不同。

目前的工作是在5.4升生物反應(yīng)器的規(guī)模上，研究生產(chǎn)介質(zhì)中氧飽和度、顆粒內(nèi)氧濃度和MPEC(滑石微粒)的應(yīng)用對土霉菌洛伐他汀生物合成的影響。因此，該研究匯集了以前分別研究過但從未同時(shí)研究過的有關(guān)土霉菌洛伐他汀生物合成的三個(gè)方面。