[摘要]目的探究內(nèi)源性apelin對大鼠丘腦底核神經(jīng)元興奮性的影響。方法利用在體細(xì)胞外單一細(xì)胞電生理實驗，使用三管玻璃微電極微壓力注射10μmol/L apelin受體阻斷劑ML221，觀察其對正常大鼠丘腦底核神經(jīng)元自發(fā)放電頻率的影響。結(jié)果丘腦底核注射ML221使8個神經(jīng)元的自發(fā)放電頻率顯著降低（t=4.263，P<0.01），使另外5個神經(jīng)元的自發(fā)放電頻率增加（t=-1.697，P>0.05）。結(jié)論丘腦底核內(nèi)源性apelin可雙向調(diào)節(jié)神經(jīng)元放電頻率，以興奮效應(yīng)為主。

Apelin是由長度為77個氨基酸的前體肽被血管緊張素酶2切割成的不同亞型的生物活性肽，根據(jù)其C末端氨基酸數(shù)量可分為apelin-13、apelin-17和apelin-36等。apelin受體屬于7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體家族。apelin及其受體系統(tǒng)廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。有文獻報道，apelin與機體運動調(diào)控密切相關(guān)。丘腦底核是基底神經(jīng)核間接通路和超直接通路中的關(guān)鍵核團，在軀體運動調(diào)控中發(fā)揮重要功能。丘腦底核深部腦刺激可以增強與運動和認(rèn)知網(wǎng)絡(luò)相關(guān)的振蕩活動，降低丘腦底核神經(jīng)元的興奮性，改善運動和認(rèn)知能力。形態(tài)學(xué)研究結(jié)果證實，丘腦底核表達(dá)apelin及其受體，然而內(nèi)源性apelin對丘腦底核神經(jīng)元放電頻率的影響目前尚不清楚。為此，本實驗用apelin受體阻斷劑ML221阻斷丘腦底核內(nèi)源性apelin，利用在體電生理記錄方法觀察內(nèi)源性apelin是否參與調(diào)控丘腦底核神經(jīng)元自發(fā)放電活動。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物成年雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量250～300 g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司。大鼠每籠5只飼養(yǎng)在（22±1）℃的溫控室內(nèi)，給予人工光照（12 h光暗循環(huán)），正常標(biāo)準(zhǔn)飲食，自由飲水。在開始實驗前適應(yīng)環(huán)境1周。所有動物實驗操作均遵循醫(yī)學(xué)倫理學(xué)原則。

1.1.2實驗藥品ML221購于美國MedChemExpress公司，烏拉坦購于上海麥克林生化科技有限公司，滂胺天藍(lán)和乙酸鈉溶液購于美國Sigma公司。

1.2實驗方法

腹腔注射烏拉坦1 g/kg麻醉大鼠，將大鼠放置在立體定向框架中，水平固定頭部，切牙桿位于雙耳線下方3.3 mm處。定位丘腦底核（前囟后3.1～4.2 mm，旁開2.0～3.0 mm，顱骨外表面下7.2～9.0 mm）并進行開顱手術(shù)。三管玻璃微電極的記錄電極管內(nèi)注入含有20 g/L滂胺天藍(lán)的0.5 mol/L乙酸鈉溶液，其余兩管則分別注入無菌生理鹽水和10μmol/L的ML221。使用液壓推進器將玻璃微電極尖端推至丘腦底核，記錄到神經(jīng)元放電并穩(wěn)定5 min后，通過生物細(xì)胞納升精密注射器將生理鹽水或ML221注射到記錄的細(xì)胞表面。放大器和數(shù)模轉(zhuǎn)換器將生物信號轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號后傳輸至計算機，用Spike 2軟件進行記錄和分析。

以加藥前120 s的平均放電頻率為基礎(chǔ)放電頻率，加藥后反應(yīng)高峰處50 s的平均放電頻率為藥物反應(yīng)頻率。如果藥物反應(yīng)頻率大于基礎(chǔ)放電頻率均數(shù)+2倍標(biāo)準(zhǔn)差或小于基礎(chǔ)放電頻率均數(shù)-2倍標(biāo)準(zhǔn)差，則認(rèn)為神經(jīng)元對藥物有反應(yīng)，否則認(rèn)為神經(jīng)元對藥物無反應(yīng)。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗數(shù)據(jù)以x±s形式表示，神經(jīng)元加藥前后放電頻率的比較采用配對t檢驗，兩組神經(jīng)元自發(fā)放電頻率的比較采用成組t檢驗;細(xì)胞放電頻率變化百分?jǐn)?shù)的比較采用曼-惠特尼秩和檢驗;ML221對神經(jīng)元自發(fā)放電頻率影響與基礎(chǔ)放電頻率的關(guān)系分析采用雙變量相關(guān)分析方法。以P<0.05為差異有顯著性。

2結(jié)果

2.1丘腦底核微量注射ML221對大鼠神經(jīng)元放電頻率的影響

在記錄到的6個丘腦底核神經(jīng)元中，微壓力注射生理鹽水后，其放電頻率由（7.44±2.39）Hz變?yōu)椋?.56±2.49）Hz（t=-0.346，P>0.05），放電頻率變化百分?jǐn)?shù)為（4.15±4.77）%。另外記錄到的18個丘腦底核神經(jīng)元，其基礎(chǔ)放電頻率為（5.39±0.94）Hz。微壓力注射10μmol/L的ML221可使其中8個神經(jīng)元的自發(fā)放電頻率由（7.44±1.41）Hz降低至（1.81±0.32）Hz（t=4.263，P<0.01）;其放電頻率降低百分?jǐn)?shù)為（72.34±6.10）%，與生理鹽水對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=-3.098，P<0.01）。在另外5個神經(jīng)元中，ML221使細(xì)胞自發(fā)放電頻率由（2.80±0.90）Hz升高至（5.06±2.12）Hz（t=-1.697，P>0.05），雖然差異無顯著意義，但單獨分析這5個細(xì)胞，其加藥后放電頻率均大于基礎(chǔ)放電頻率均數(shù)+2倍標(biāo)準(zhǔn)差，故認(rèn)為ML221增加其放電頻率;這5個神經(jīng)元放電頻率增加的百分?jǐn)?shù)為（64.85±19.86）%，與生理鹽水對照組比較差異有顯著性（Z=2.739，P<0.01）。在剩余的5個丘腦底核神經(jīng)元中，注射ML221后，其自發(fā)放電頻率由（3.08±1.51）Hz變?yōu)椋?.24±1.56）Hz（t=-2.390，P>0.05），加藥后放電頻率均小于基礎(chǔ)放電頻率均數(shù)+2倍標(biāo)準(zhǔn)差且大于基礎(chǔ)放電頻率均數(shù)-2倍標(biāo)準(zhǔn)差，放電頻率變化的百分?jǐn)?shù)為（8.82±4.38）%。見圖1。

2.2ML221對丘腦底核神經(jīng)元自發(fā)放電頻率調(diào)控與基礎(chǔ)放電頻率及神經(jīng)元放電模式的關(guān)系

上述ML221引起放電頻率降低的8個丘腦底核神經(jīng)元的自發(fā)放電頻率為（7.44±1.41）Hz，而ML221引起放電頻率增加的5個丘腦底核神經(jīng)元的自發(fā)放電頻率為（2.80±0.90）Hz，兩組神經(jīng)元自發(fā)放電頻率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.392，P<0.05）。ML221引起的放電頻率降低（r=-0.409，P>0.05）和增加（r=0.620，P>0.05）與基礎(chǔ)放電頻率沒有相關(guān)性。

根據(jù)放電間隔直方圖和自相關(guān)圖分析，丘腦底

核神經(jīng)元分為規(guī)則放電、不規(guī)則放電和簇狀放電3種放電模式。在ML221引起放電頻率降低的8個神經(jīng)元中，這3種放電模式所占比例分別為12.5%、25.0%和62.5%;而在ML221引起放電頻率增加的5個丘腦底核神經(jīng)元中，這3種放電模式所占比例分別為20.0%、20.0%和60.0%。

3討論

基底神經(jīng)核是包括紋狀體、蒼白球、黑質(zhì)及丘腦底核等核團在內(nèi)的皮質(zhì)下一系列核團的總稱，其中紋狀體是其輸入結(jié)構(gòu)，蒼白球內(nèi)側(cè)部和黑質(zhì)網(wǎng)狀帶是其輸出結(jié)構(gòu)。輸入、輸出結(jié)構(gòu)之間核團的信息交流構(gòu)成兩大經(jīng)典環(huán)路，即直接通路和間接通路。

此外，丘腦底核也可直接接受來自興奮性皮質(zhì)和丘腦的纖維投射（即超直接通路）。直接通路提高大腦皮質(zhì)的興奮性，而間接通路和超直接通路則具有相反的作用，三條通路相互協(xié)調(diào)、相互制約以保證運動的平衡性。

丘腦底核是基底神經(jīng)核最主要的核團之一，也是唯一的興奮性核團，其神經(jīng)元電活動變化在調(diào)節(jié)皮質(zhì)神經(jīng)元興奮性方面具有重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)運動計劃被終止時，丘腦底核顯著激活。因此，丘腦底核也被認(rèn)為是運動控制系統(tǒng)中起"制動"作用的主要核團之一。由此推測，丘腦底核神經(jīng)元基礎(chǔ)放電頻率的改變，可能通過基底神經(jīng)核內(nèi)的直接通路、間接通路或超直接通路來調(diào)控皮質(zhì)運動區(qū)神經(jīng)元興奮性，最終參與運動的調(diào)控。

Apelin及其受體系統(tǒng)在大腦、心臟、胃、脂肪組織和血管內(nèi)皮細(xì)胞等器官組織中均有表達(dá)，具有廣泛而重要的生理功能。研究發(fā)現(xiàn)，apelin缺乏加速肌萎縮側(cè)索硬化癥的病理進展。apelin-13能抑制促炎細(xì)胞因子的分泌，促進脊髓損傷動物的感覺功能恢復(fù)，并增加其運動行為。本研究觀察到，丘腦底核微量注射apelin受體阻斷劑ML221可改變神經(jīng)元的自發(fā)放電頻率，提示丘腦底核內(nèi)源性apelin參與調(diào)控神經(jīng)元興奮性。以往也有研究觀察到內(nèi)源性apelin發(fā)揮重要功能。例如，鞘內(nèi)單次注射apelin受體拮抗劑ML221，可暫時減少慢性壓榨損傷引起的疼痛過敏；急性應(yīng)激可引起下丘腦室旁核內(nèi)apelin受體mRNA的水平升高，而慢性反復(fù)應(yīng)激則可誘導(dǎo)apelin受體表達(dá)的持久上調(diào)。

本研究觀察到，丘腦底核內(nèi)源性apelin對神經(jīng)元自發(fā)放電具有雙向效應(yīng)。丘腦底核給予ML221可以引起大部分神經(jīng)元放電頻率降低，提示內(nèi)源性apelin增加神經(jīng)元的興奮性；而在少部分神經(jīng)元，ML221可增加其放電頻率，提示內(nèi)源性apelin抑制其興奮性。之前也有關(guān)于apelin雙向效應(yīng)的相關(guān)報道。有研究運用膜片鉗技術(shù)發(fā)現(xiàn)，apelin-13對穹隆下器神經(jīng)元具有除極化和超極化的雙向效應(yīng)，這些效應(yīng)似乎分別是由非選擇性陽離子通道和鉀通道的激活而引發(fā)。本研究結(jié)果表明，ML221產(chǎn)生抑制和興奮效應(yīng)的兩組神經(jīng)元的基礎(chǔ)放電頻率存在差異，推測可能與丘腦底核神經(jīng)元的種類不同有關(guān)。近期的形態(tài)學(xué)研究揭示丘腦底核確實存在有軸突側(cè)支和無軸突側(cè)支兩種不同類型神經(jīng)元。雖然該研究同時報道了這兩類不同形態(tài)神經(jīng)元的膜電阻、膜電容、動作電位幅度和興奮閾值等電生理特性無顯著差異，但是并沒有報道這兩類神經(jīng)元的自發(fā)放電頻率是否存在差異。因此，就目前的研究尚不能確定丘腦底核是否存在具有不同自發(fā)放電頻率的神經(jīng)元亞群。但之前有文獻報道，與丘腦底核有緊密形態(tài)和功能聯(lián)系的蒼白球，其兩類神經(jīng)元（小清蛋白陽性神經(jīng)元和PAS結(jié)構(gòu)域蛋白1陽性神經(jīng)元）的自發(fā)放電頻率有差異。本實驗室最近的電生理實驗研究結(jié)果顯示，apelin-13對蒼白球神經(jīng)元的自發(fā)放電頻率調(diào)控亦具有興奮和抑制的雙向效應(yīng)。由上述研究可見，ML221對丘腦底核神經(jīng)元興奮性的雙向效應(yīng)可能因為不同類型神經(jīng)元介導(dǎo)的信號通路和離子通道機制不同。既往研究表明，在不同的細(xì)胞apelin可以激活不同的信號通路而發(fā)揮不同的作用。例如，激活apelin受體/緩激肽1受體異源二聚體促進內(nèi)皮型一氧化氮合酶磷酸化并導(dǎo)致Gαq介導(dǎo)的PKC信號通路活性顯著增加。而在轉(zhuǎn)染apelin受體的中國倉鼠卵巢細(xì)胞中，apelin抑制forskolin誘導(dǎo)的環(huán)磷酸腺苷產(chǎn)生，提示apelin受體與Gαi有功能性聯(lián)系。apelin在表達(dá)apelin受體的293T細(xì)胞中誘導(dǎo)Akt/PKB的磷酸化，但在沒有表達(dá)apelin受體的293T細(xì)胞中則沒有該效應(yīng)。此外，還有研究觀察到apelin對血壓也可以發(fā)揮雙向調(diào)節(jié)作用。apelin-13與其受體結(jié)合，能夠拮抗血管緊張素Ⅱ?qū)ρ艿氖湛s作用，從而舒張血管、降低血壓。而在慢性腎病病人中，apelin-13可以直接引起人臍靜脈血管平滑肌細(xì)胞肌球蛋白輕鏈的增多，從而升高血壓。

綜上所述，內(nèi)源性apelin可雙向調(diào)節(jié)丘腦底核神經(jīng)元自發(fā)放電頻率，以興奮效應(yīng)為主。本實驗結(jié)果為進一步探討丘腦底核內(nèi)apelin及其受體系統(tǒng)可能作為運動相關(guān)疾病的潛在靶點提供了一定的理論和實驗依據(jù)。